Analyse fonctionnelle et cinétique de la β-lactamase OXA-143 et de son mutant P227S

Santos Vignoles, Gabriella (2023). Analyse fonctionnelle et cinétique de la β-lactamase OXA-143 et de son mutant P227S Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie et biotechnologie, 75 p.

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Résumé

La production d’enzymes β-lactamases par les bactéries à Gram-négatif représente un des plus importants mécanismes de résistance aux antibiotiques. Ces enzymes ont la capacité de dégrader le noyau des antibiotiques de type β-lactamines, i.e. pénicillines, céphalosporines, carbapénèmes et monobactames. Les β-lactamases de classe D hydrolysant les carbapénèmes (LDHC) sont des enzymes de type oxacilinases qui sont actives contre ces antibiotiques de dernier recours. La majorité des oxacilinases ont été identifiées chez Acinetobacter baumannii, un pathogène causant des infections nosocomiales. Parmi les LDHCs, OXA-143 partage avec les autres oxacilinases un motif catalytique STFK strictement conservé et la boucle β5-β6, qui influence la spécificité de reconnaissance des substrats. Des études récentes ont identifié qu’un mutant P227S dans la boucle β5-β6 semble être associé à une activité enzymatique supérieure à l’enzyme native. En revanche, les mécanismes moléculaires et évolutifs qui sous-tendent l’apparition de cette mutation et son effet fonctionnel demeurent inconnus. L'hypothèse formulée est que la réorganisation structurale et/ou dynamique du site actif de OXA-143 pourrait permettre une plus grande efficacité catalytique et/ou une meilleure affinité des substrats chez P227S. L'optimisation de l'expression et de la purification de OXA-143 native et du mutant P227S a été entreprise dans le but de réaliser des études cinétiques et des analyses bactériennes des concentrations minimales inhibitrices (CMI) en présence de pénicillines, de céphalosporines, de carbapénèmes et de monobactames. Les résultats mettent en lumière l'effet cellulaire et cinétique de cette mutation dans la résistance chez des pathogènes opportunistes comme A. baumannii.

The production of β-lactamase enzymes by Gram-negative bacteria is the most important antibiotic resistance mechanism. These enzymes can break down the β-lactam ring of β-lactam antibiotics, i.e., penicillin, cephalosporins, carbapenems and monobactams. Class D β-lactamases hydrolysing carbapenems (CHDL) are oxacilinase enzymes that are active against these last resort antibiotics. The majority of oxacilinases have been identified in Acinetobacter baumannii, a pathogen causing nosocomial infections. Among LDHCs, OXA-143 shares with other oxacilinases a strictly preserved STFK catalytic motif and the β5-β6 loop, which influence the specificity of substrate recognition. Recent studies have identified that a P227S mutant in the β5-β6 loop appears to be associated with higher enzyme activity than the native enzyme. However, the molecular and evolutionary mechanisms underlying this mutation and its functional effect remain unknown. We hypothesized that a structural and/or dynamic reorganization of the active site of OXA-143 could allow for greater catalytic efficiency and/or better substrate affinity in P227S. Optimization of expression and purification of native OXA-143 and mutant P227S was undertaken to perform kinetic studies and minimum inhibitory concentrations (MIC) assays in the presence of penicillin, cephalosporins, carbapenems and monobactams. Our results highlight the cellular and kinetic effect of this mutation in resistance in opportunistic bacteria such as Acinetobacter baumannii.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Doucet, Nicolas
Mots-clés libres:	β-lactamases; OXA-143; LDHC; Acinetobacter baumannii; carbapenemases; chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC); cinétique enzymatique; concentrations minimales inhibitrices (CMI); immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC); enzyme kinetics; minimum inhibitory concentrations (MIC)
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	09 juill. 2024 15:37
Dernière modification:	09 juill. 2024 15:37
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15805

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