Embryotoxicité des produits pétroliers dans différentes conditions environnementales chez les poissons et les amphibiens.

Lara-Jacobo, Linda Ramona (2020). Embryotoxicité des produits pétroliers dans différentes conditions environnementales chez les poissons et les amphibiens. Thèse. Québec, Doctorat en sciences de l'eau, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, 205 p.

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Résumé

L'attachement aux hydrocarbures n'a pas diminué ces dernières années malgré le développement de nouvelles technologies vertes. L'extraction et le transport de bitume brut et de bitume dilué continuent d'influer sur notre environnement. De nombreuses catastrophes de marées noires dans les écosystèmes aquatiques se sont produites, par exemple la marée noire de la rivière Kalamazoo (juin 2010) et du Deepwater Horizon (avril 2010) pour ne citer que quelques cas les plus célèbres. Connaître et comprendre les effets du pétrole et de ses dérivés sur les écosystèmes aquatiques est de la plus haute importance. Cela nous aidera à rechercher des alternatives stratégiques pour réduire ces risques dans les écosystèmes exposés. Les détails concernant l’écotoxicité associée au pétrole est décrite au Chapitre 1. Dans cette thèse, trois différents générateurs de fraction accommodee à l'eau (WAF) ont été réalisés et comparés entre eux sur des organismes aquatiques, soit la production de WAF en laboratoire à la température ambiante, soit dans un réservoir-simulateur de vagues à 2 °C ou soit à 15 °C. Dans l’expérience de la production de WAF en laboratoire (Chapitre 2), les objectifs de cette étude étaient d’étudier la toxicité du dilbit pour les embryons de grenouilles en développement et d’identifier les mécanismes d’action moléculaires impliqués. Des embryons fertilisés du xénope tropical (Silurana tropicalis) ont été exposés pendant 72 h à des fractions de WAF variant de 0,7 à 8,9 µg/L de Hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP) totaux et à des WAF chimiquement améliorés (CEWAF) variant de 0,09 à 56,7 µg/L HAP totaux) préparées avec le bitume dilué (dilbit) Access Western Blend (AWB) et Cold Lake Blend (CLB). Les CEWAF des deux dilbits ont considérablement augmenté la mortalité embryonnaire et l’incidence de malformations dans les traitements les plus testés, alors que les traitements WAF n’ont entraîné aucun effet toxique observable. Des augmentations des taux d'ARNm du cytochrome P450 1A (cyp1a) ont été observées pour tous les traitements de dilbit suggérant que la détoxification de phase I est activée chez les larves de grenouilles exposées au dilbit. Lorsqu'elles étaient exposées à des concentrations de HAP totaux comprises entre 0,09 et 8,9 µg/L, les grenouilles ne présentaient aucune malformation observable, mais exprimaient des augmentations significatives des niveaux d'ARNm de cyp1a (de 2 à 25 fois plus élevés que le témoin), ce qui indique que ce gène est un biomarqueur d'exposition approprié pour les larves de grenouilles. Également, lorsque les concentrations de dilbit étaient plus élevées, soit environ de 46,6 µg/L ou plus de HAP totaux, le phénotype de la grenouille malformée a été observé. Ces animaux exprimaient aussi de très hauts taux d’induction de l'ARNm de la cyp1a (plus de 250 fois celui du témoin), ce qui indique que ce gène peut également être approprié pour signaler la réponse de détoxication de l’individu au contaminant. L'expression de plusieurs gènes liés à la détoxication cellulaire et à la perturbation du système endocrinien a été mesurée, mais n'a pas été altérée de manière significative par les traitements. En résumé, le taux d'ARNm de la cyp1a est un paramètre très sensible pour mesurer les changements moléculaires subtils induits par l'exposition aux HAP totaux chez les larves de grenouilles. Les données suggèrent qu'une concentration de HAP supérieure à 46 µg/L serait toxique pour les embryons de S. tropicalis en développement. Dans un simulateur de vagues, deux expériences ont été effectuées. La première utilisait un pétrole brut léger avec une températures de l'air et de l'eau de 14 °C et 15 °C, respectivement (Chapitre 3). Des échantillons d'eau ont été prélevés dans une cuve qui permet de simuler des vagues cinq fois au cours d'une expérience de vieillissement de pétrole d’une durée de 28 jours. Des fractions collectées aux jours 1, 6, 14, 21 et 28 ont été utilisé pour réaliser des expositions toxicologiques sur des embryons de tête-de-boule (Pimephales promelas). Pour chacune des périodes d'échantillonnage, les embryons nouvellement fécondés ont été exposés à une dilution en série de WAF, à de l'eau de rivière non contaminée (utilisée pour générer le WAF) et à de l'eau reconstituée en laboratoire. Les embryons de poissons ont été élevés jusqu'à l'éclosion et ont été utilisé pour une évaluation morphologique et une analyse de biomarqueurs, et les expositions ont été poursuivies jusqu'à l'éclosion, où le reste des larves a été récolté. Bien que la mortalité n’aie pas été significativement altérée par les traitements au pétrole brut, la sévérité des malformations observées a démontré une forte réponse en fonction de la concentration avec tous les traitements de pétrole brut. Les données suggèrent que les jours 14, 21 et 28 étaient les fractions les plus toxiques. L'analyse chimique a confirmé l'augmentation des concentrations de C10-C50 et des HAP totaux avec le temps. L'analyse de l’expression du cyp1a a démontré son augmentation, mais seulement au jour 14. Cette étude démontre l'importance d’étudier la toxicité des pétroles chez les espèces aquatiques lorsque les pétroles se dégradent dans l’environnement. La deuxième expérience a permis de contraster la toxicité du dilbit CLB qui vieillit à une température de l'air et de l'eau de à 2 °C et à 15 °C (Chapitre 4). Des échantillons d'eau ont été prélevés dans le réservoir de déversement cinq fois au cours de l'expérience de 35 jours (périodes 1, 6, 14, 28 et 35) et ont été utilisés pour réaliser des expositions au début de la vie à l'aide des têtede-boule, et ce, pour les deux régimes de température. Pour chaque période d'échantillonnage, les embryons nouvellement fécondés ont été exposés à une dilution en série des échantillons d'eau du réservoir d'origine, à de l'eau de rivière non contaminée (utilisée dans le réservoir) et à un système de contrôle de l'eau reconstituée. Les embryons ont été élevés jusqu'à l'éclosion. La mortalité embryonnaire et larvaire a été notée, ainsi que le temps d'éclosion, l'incidence et le type de malformations, le nombre de battements cardiaques/min et l'activité EROD in vivo. Les résultats ont montré que l'exposition au CLB avait des effets négatifs importants sur les poissons embryonnaires, notamment une augmentation du taux de mortalité et de malformations, ainsi que des modifications de la fréquence des battements cardiaques et de l'activité EROD. Le taux de mortalité le plus élevé a été observé aux périodes 1 et 6, tandis que l'incidence des malformations, le nombre de battements cardiaques et l'activité EROD étaient beaucoup plus affectés par les concentrations de CLB les plus élevées testées pour chacun des jours d’analyse. L'analyse en RTPCR en temps réel d'une série de gènes liés à la détoxification des xénobiotiques et au stress oxydatif a été effectué. Ce projet de recherche démontre l’importance de tester la toxicité inhérente associée à un plus grand nombre de conditions naturelles de vieillissement des pétroles, car l’embryotoxicité des espèces aquatiques varie en fonction du profil chimique et des concentrations des pétroles. La discussion générale de la thèse et les conclusions finales sont présentées au Chapitre 5.

Attachment to hydrocarbons has not diminished in recent years despite the development of new green technologies. The extraction and transportation of raw and diluted bitumen (dilbit) continue to affect our environment. Numerous oil spill disasters in aquatic ecosystems have occurred, for example, the Kalamazoo River (June 2010) and the Deepwater Horizon (April 2010) oil spills to name a few. Knowing and understanding the effects of petroleum and its derivatives on aquatic ecosystems is of the utmost importance. This will help us to seek strategic alternatives to reduce these risks in exposed ecosystems. Details regarding the ecotoxicity associated with petroleum products are described in Chapter 1. In this thesis, three different generators of water accommodated fraction (WAF) were produced and compared with each other on aquatic organisms, either the production of WAF in the laboratory at room temperature, or in a wave simulator tank at 2 °C or either at 15 °C. In the experiment of producing WAF in the laboratory (Chapter 2), the objectives of this study were to study the toxicity of dilbit to developing frog embryos and to identify the molecular mechanisms of action involved. Fertilized Western clawed frog (Silurana tropicalis) embryos were exposed for 72 h to WAF fractions ranging from 0.7 to 8.9 µg/L total polycyclic aromatic hydrocarbons (or TPAH) and to chemically enhanced WAF (CEWAF) varying from 0.09 to 56.7 µg/L TPAH prepared with the Access Western Blend (AWB) and Cold Lake Blend (CLB) dilbits. CEWAFs from both dilbits significantly increased embryonic mortality and the incidence of malformations in the highest concentration, while WAF treatments had no observable toxic effects. Increases in cytochrome P450 1A (cyp1a) mRNA levels have been observed for all dilbit treatments suggesting that phase I detoxification is activated in frog larvae exposed to dilbit. When exposed to concentrations ranging between 0.09 and 8.9 µg/L TPAH, the frogs showed no observable malformation, but expressed significant increases in cyp1a mRNA levels (2 to 25 times higher than the control), indicating that this gene is an appropriate biomarker of PAH exposure for frog larvae. Also, when dilbit concentrations were higher, to approximately 46.6 µg/L TPAH or higher, the phenotype of the malformed frog was observed. These animals also expressed very high induction rates of cyp1a mRNA (more than 250 times that of the control), which indicates that this gene may also be suitable for signaling the detoxification response of the individual to the contaminant. The expression of several genes linked to cell detoxification and disruption of the endocrine system was measured but was not significantly altered by the treatments. In summary, the level of cyp1a mRNA is a very sensitive parameter for measuring the subtle molecular changes induced by exposure to TPAHs in frog larvae. The data suggest that a PAH concentration greater than 46 µg/L TPAHs would be toxic to developing S. tropicalis embryos. In a wave simulator, two experiments were carried out. The first used light crude oil with a water temperature of 15 °C (Chapter 3). Water samples were taken five times from a tank that simulates waves during a 28-day oil aging experiment. Fractions collected on days 1, 6, 14, 21, and 28 were used to carry out toxicological exposures on fathead minnow embryos (Pimephales promelas). For each of the sampling periods, the newly fertilized embryos were exposed to serial WAF dilution, uncontaminated river water (used to generate WAF), and reconstituted water in the laboratory. Fish embryos were raised until hatching, half were used for morphological evaluation and biomarker analysis, and exposures were continued until hatching, where the rest of the larvae were harvested. Although mortality was not significantly altered by crude oil treatments, the severity of the malformations observed demonstrated a strong concentration-dependent response with all crude oil treatments. The data suggest that days 14, 21, and 28 were the most toxic fractions. Chemical analysis confirmed the increase in C10-C50 and TPAH concentrations over time. Analysis of the expression of cyp1a demonstrated its increase, but only on day 14. This study demonstrates the importance of studying the toxicity of oils in aquatic species when oils degrade in the environment. The second experiment contrasted the toxicity of the CLB dilbit which ages at an air and water temperature of 2 °C and 15 °C (Chapter 4). Water samples were taken five times from the spill tank during the 35-day experiment (periods 1, 6, 14, 28, and 35) and were used to make early life exposures to the help of P. promelas, for the two temperature regimes. For each sampling period, the newly fertilized embryos were exposed to serial dilution of the water samples from the original reservoir, uncontaminated river water (used in the reservoir), and a system of control of the reconstituted water. The embryos were reared until hatching. Embryonic and larval mortality was noted, as well as hatching time, incidence and type of malformations, number of heart beats/min and EROD activity in vivo. The results showed that exposure to CLB had significant negative effects on embryonic fish, including an increased rate of mortality and deformities, as well as changes in the frequency of heartbeat and EROD activity. The highest mortality rate was observed in periods 1 and 6, while the incidence of malformations, the number of heart beats, and EROD activity were much more affected by the highest CLB concentrations tested for each of the days of analysis. Real-time RT-PCR analysis of a series of genes linked to the detoxification of xenobiotics and to oxidative stress was carried out. This research project demonstrates the importance of testing the inherent toxicity associated with a greater number of natural aging conditions for oils since the embryotoxicity of aquatic species varies depending on the chemical profile and concentrations of oils. The general discussion of the thesis and the final conclusions are presented in Chapter 5.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Langlois, Valérie
Mots-clés libres:	embryons de poissons; embryons de grenouilles; bitume dilué; pétrole brut; malformations; expression des gènes; cyp1a; fish embryos; frog embryos; diluted bitumen; crude oil; malformations; gene expression
Centre:	Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt:	15 févr. 2021 15:32
Dernière modification:	06 oct. 2021 15:27
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/11328

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