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Degradation of selected microbial aflatoxins from ASPERGILLUS PARASITICUS by partial purified laccase from CORIOLUS HIRSUTUS

Borgomano, Sabrina (2015). Degradation of selected microbial aflatoxins from ASPERGILLUS PARASITICUS by partial purified laccase from CORIOLUS HIRSUTUS Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 210 p.

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Résumé

La production des principales formes des aflatoxines par des souches fongiques sélectionnées, comprenant Aspergillus flavus et Aspergillus parasiticus, ainsi que leur dégradation par la laccase de Coriolus hirstutus ont été étudiés. A. parasiticus s’est révélée être la souche la plus appropriée en termes de sa capacité à produire les taux plus élevés d’aflatoxines, lorsque la gélose dextrosée à la pomme de terre était utilisée comme milieu initial d'inoculation. L’utilisant d’une concentration de 150 g/L d’une biomasse fongique, obtenue après 168 h d'incubation, permettait d'obtenir la concentration la plus élevée de 73,603 mg d’aflatoxines/L de milieu de culture. L'effet de cryoprotectants sur la récupération des extraits secs d’aflatoxines a également été étudié, où 1,5% de mannitol a été trouvé comme étant le plus adéquate pour obtenir à la fois une plus grande quantité et une meilleure qualité d’extraits d’aflatoxines. Une chromatographie liquide à haute performance en phase inverse, à une longueur d'onde de 365 nm, a été utilisée pour séparer et caractériser les aflatoxines, où les aflatoxines AFG2, AFG1, AFB2 et AFB1, étaient éluées à 3,70, 4,20, 4,80 et 5,08 min, respectivement. La biocatalyse par la laccase partiellement purifiée, provenant de Coriolus hirsutus, en utilisant les principales aflatoxines, AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2, comme substrats a été étudiée. L'extrait enzymatique présentait une plus forte activité spécifique de 0,133, 0,124, 0,155 et 0,138 μmol de produit dégradé par mg de protéine par minute, pour les aflatoxines AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2, respectivement, à une température de 57.5ºC et un pH de 6,0. Les études cinétiques ont indiqué que la valeur de km était de 0,646, 0,128, 0,237 et 0,284 μM et celle de Vmax était de 10,40, 9,68, 13,00 et 10,80 pour les aflatoxines AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2, respectivement. En outre, la présence de 0,4 mM de dithiothréitol et d'acide diéthyldithiocarbamique inhibait fortement l'activité de la laccase, alors que 10 mM d’acide kojique et 0,01 mM d’'acide p-coumarique favorisait grandement son activité. Une stratégie expérimentale pour rechercher les conditions optimales de la dégradation des principales aflatoxines a été étudiée. Un plan de composites centrés (CCD) à cinq-niveauxpar- trois-facteurs a été utilisé pour évaluer l'effet de la concentration de l'enzyme X1, la concentration des aflatoxines X2, et le temps d'incubation X3, sur le pourcentage de dégradation de chaque aflatoxine, dont les aflatoxines AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2. Les résultats expérimentaux ont montré que les valeurs prédites pour la dégradation des aflatoxines étaient en adéquation avec les résultats expérimentaux, où la valeur R2 du modèle polynômial pour la prédiction du pourcentage de dégradation des aflatoxines AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2 était de 0,89, 0,94, 0,92 et 0,89, respectivement. En outre, les résultats indiquaient également que le temps d'incubation et la concentration de l'enzyme, à des valeurs élevées, influençaient plus fortement la dégradation de l’aflatoxine AFB1 que la concentration du substrat. Pour la dégradation de l’aflatoxine AFB2, la concentration de l'enzyme avec un coefficient plus élevé avait un effet plus important que le temps d'incubation et la concentration du substrat. Pour la dégradation des aflatoxines AFG1 et AFG2, les concentrations d’enzyme et de substrats, à des valeurs élevées, engendraient des effets plus importants que le temps d'incubation. Les conditions optimales prédites pour une dégradation respective de 38,2, 30,1, 76,4 et 100% des aflatoxines AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2, étaient 31,5 U/nmol d’aflatoxines pour l’enzyme, 96,2, 191,0, 32,7 et 42,2 nmol, respectivement, pour les aflatoxines AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2 et 55,2 min pour le temps. La caractérisation des produits finaux issus de la dégradation par la laccase a été obtenue par spectroscopie à transformée de Fourier (FTIR), par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), ainsi que par une chromatographie liquide couplait à un spectromètre de masse (LC/MS). Les analyses structurales ont montré que la dégradation des principales aflatoxines par la laccase a mené à la production de plusieurs produits de dégradation, de structures et de masses moléculaires variées. Le pic de l’ion moléculaire m/z le plus abondant était de 327,254, 205,069, 205,069 et 196,656 Da, pour les aflatoxines AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2, respectivement. Les analyses FTIR et MS ont suggéré que les principaux mécanismes de dégradation des aflatoxines par laccase pouvait être l’époxydation, l’hydroxylation, l’O-déméthylation, la déshydrogénation, la déshydratation, la réduction de la double liaison et celle des cétones ainsi que la perte de cétone, d’oxygène, de carbone et de méthyle, conduisant à la modification soit du groupe furofurane, de la coumarine ou du cycle lactone, ainsi qu’à la formation de produits non toxiques.

Abstract

The production of the major aflatoxin isorforms by selected fungal strains, including Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus as well as their degradation by a laccase from Coriolus hirstutus were investigated. A. parasiticus was found to be the most appropriate one in term of its capacity to produce the highest aflatoxins level, when potato dextrose agar was used as the initial inoculation medium. Using a fungal biomass concentration of 150 g/L obtained after 168 h of incubation provided the highest yield of 73.603 mg aflatoxins/L culture medium. The effect of cryoprotectants on the dry aflatoxins recovery was also investigated, where 1.5% of mannitol was found the most appropriate for the recovery of high yield and improved quality of aflatoxins extract. A reverse-phase/high-performance liquid chromatography, at 365 nm, was used to separate and characterize the aflatoxins, where AFG2, AFG1, AFB2 and AFB1, were eluted at 3.70, 4.20, 4.80 and 5.08 min, respectively. The biocatalysis of a partial purified laccase (PPL), from Coriolus hirsutus, using the major aflatoxin isoforms, AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2, as substrates, was investigated. The PPL exhibited the highest specific activity of 0.133, 0.124, 0.155 and 0.138 μmol of degradation product per mg protein per min, for AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2, respectively, at 57.5ºC and pH 6.0. The kinetic studies indicated that the Km value was 0.646, 0.128, 0.237 and 0.284 μM and a Vmax value was 10.40, 9.68, 13.00 and 10.80 for AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2, respectively. In addition, the presence of 0.4 mM of dithiothreitol and diethyldithiocarbamic acid strongly inhibited the laccase activity, whereas 10 mM of kojik acid and 0.01 mM of p-coumaric acid greatly promoted its activity. An experimental strategy for seeking the optimum conditions of the degradation of the major aflatoxin isoforms was investigated. A five-level by three factors central composite design (CCD) was used to evaluate the effect of the enzyme concentration X1, the aflatoxins concentration X2 and the incubation time X3, on the percentage of degradation for each aflatoxin, including AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2. The experimental findings demonstrated that the predicted values of aflatoxins degradation were in good agreement with the experimental results, where the R2 value of the polynomial model for the prediction of AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 degradation percentage was 0.89, 0.94, 0.92 and 0.89, respectively. In addition, the results also indicated that the incubation time and the enzyme level, with higher coefficient values, greatly influenced aflatoxin AFB1 degradation more than the substrate concentration. For AFB2 degradation, enzyme level, with higher coefficient, had higher effect than incubation time and substrate concentration. For AFG1 and AFG2 degradation, the substrate and enzyme concentrations, with higher coefficient values, had higher effects than incubation time. The optimal predicted conditions for a 38.2, 30.1, 76.4 and 100% of AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 degradation, respectively, were 31.5 U/nmol aflatoxins for enzyme, 96.2, 191.0, 32.7 and 42.2 nmol, respectively, for AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 and 55.2 min for time. The characterization of the laccase-catalyzed end products was obtained by Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), high-performance liquid chromatography (HPLC), and liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS). The structural analyses showed that the laccasecatalyzed degradation of major aflatoxin isoforms resulted in the production of several degradation products, with a wide range of structures and molecular weights. The most abundant molecular ion peak was at m/z 327.254, 205.069, 205.069 and 196.656 Da for AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2, respectively. The FTIR and MS analyses also showed that the major mechanisms of aflatoxins degradation by laccase were epoxydation, hydroxylation, Odemethylation, deshydrogenation, dehydratation, reduction of the double bond and ketoreduction a well as the loss of ketone, oxygen, carbon and methyl molecules, leading to the modification either of the furofuran moiety, the coumarin or the lactone ring as well as to the formation of nontoxic products.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Lacroix, Monique
Co-directeurs de mémoire/thèse: Kermasha, Selim
Mots-clés libres: aflatoxine ; mycotoxine
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 07 mars 2016 20:32
Dernière modification: 07 mars 2016 20:32
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/3294

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