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Clonage, expression, purification et caractérisation fonctionnelle de RhlA chez Pseudomonas aeruginosa

Richardson, Anne-Pascale (2009). Clonage, expression, purification et caractérisation fonctionnelle de RhlA chez Pseudomonas aeruginosa Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 151 p.

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Résumé

Les rhamnolipides sont des biosurfactants extracellulaires de type glycolipidique, synthétisés par les bactéries du genre Pseudomonas. Ils ont été très largement étudiés depuis leur découverte par Jarvis et Johnson en 1949. Ils sont essentiels au maintien de l'architecture des biofilms, en plus d'augmenter l'hydrophobicité cellulaire. Cependant de récentes études ont démontré que P. aeruginosa synthétisait une nouvelle classe de biosurfactants, les acides 3-(3-hydroxyalcanoyloxy)-alcanoiques (HAAs ou dilipides), précurseurs des rhamnolipides. Les HAAs présentent des propriétés biosurfactantes intéressantes en abaissant plus la tension de surface que les rhamnolipides à des concentrations identiques. De plus, les HAAs moussent beaucoup moins que les rhamnolipides ce qui leur confère un avantage considérable pour de multiples applications industrielles. Les HAAs se sont aussi révélés être des agents " mouillants , extracellulaires qui contribuent à certains types de mobilité cellulaire bactérienne, notamment le "swarming". Ainsi les HAAs ne semblent pas être que de simples intermédiaires dans la voie de biosynthèse des rhamnolipides. Ils présentent des caractéristiques utiles pour le fonctionnement de P.aeruginosa ainsi que de nombreux intérêts pour l'industrie et le domaine médical. Le gène rhlA de l'opéron rhlAB est indispensable à la production des HAAs. On a retrouvé de faibles quantités de HAAs dans le milieu d'une culture de la souche sauvage PG201, aucun dans le milieu de culture d'un mutant dérivé rhlA (U0299), mais de fortes concentrations dans le milieu de culture d'un mutant rhlB (U0287). Au début de ce projet, il était connu que rhlA avait un rôle déterminant dans la synthèse des HAAs, mais aucune étude n'avait encore défini sa fonction enzymatique, ni caractérisé ses propriétés physico-chimiques. C'est pourquoi ce projet porte sur le clonage, l'expression, la purification et la caractérisation fonctionnelle de RhlA chez P. aeruginosa. Cette étude permettra d'améliorer les connaissances sur la voie de biosynthèse des rhamnolipides mais aussi éventuellement de développer une technique de production des HMs, qui sont des surfactants biodégradables, pour des fins de bioremédiation ou pour d'autres applications industrielles. Les expériences destinées à caractériser la fonction enzymatique de RhlA seront présentées, depuis la construction du vecteur d'expression pUCP18 et son clonage dansE. coli et la souche U0299, en passant par les étapes de purification via une colonne de nickel, jusqu'aux tests enzymatiques préliminaires qui indiquaient que les 3-hydroxyacyl-CoA seraient des substrats potentiels de RhlA pour la production de dilipides.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Lépine, François
Mots-clés libres: biosurfactant ; rhamnolipide ; dilipide
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 16 nov. 2015 21:53
Dernière modification: 16 nov. 2015 21:53
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/276

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