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Analyse de la diversité fonctionnelle d'un biofilm impliqué dans l'élimination des nitrates en eau salée : étude du biofilm dénitrifiant du Biodôme de Montréal

Auclair, Julie (2011). Analyse de la diversité fonctionnelle d'un biofilm impliqué dans l'élimination des nitrates en eau salée : étude du biofilm dénitrifiant du Biodôme de Montréal Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 183 p.

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Résumé

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La dénitrification biologique est de plus en plus employée pour éliminer le nitrate des eaux usées constituant une alternative économique aux méthodes physiques. Cependant, cette activité repose sur le développement de microorganismes capables de respirer les oxydes d'azote et des les transformer en N2. Le développement de cette flore dénitrifiante est influencé par divers facteurs rendant ainsi souvent les performances de dénitrification variables. Une meilleure connaissance des microorganismes présents dans ces systèmes est, de ce fait, nécessaire à 1'élaboration de systèmes de dénitrification performants et stables. Le Biodôme de Montréal opère un réacteur à lit mobile, alimenté au méthanol, pour éliminer le nitrate d'un aquarium de 3 millions de litres d'eau de mer artificielle nommé le Saint­ Laurent Marin. Les microorganismes naturellement présents dans 1'affluent du système de dénitrification colonisent les supports mobiles du réacteur formant un biofilm. Cependant, depuis son installation le réacteur n'a jamais atteint les performances de dénitrification attendues. L'objectif de mon projet de doctorat était donc de déterminer la fonctionnalité des populations bactériennes présentes dans le biofilm dénitrifiant. L'un des objectifs spécifiques de ce projet était d'identifier les bactéries méthylotrophes dénitrifiantes dans le biofilm. Le méthanol constitue une source de carbone pour les populations microbiennes du bio:film à l'étude. Afin d'identifier les populations bactériennes dénitrifiantes responsables de la consommation du méthanol dans le biofilm des essais de stable isotope probing (SIP) ont été entrepris. Les résultats obtenus ont démontré que les bactéries affiliées au genre Methylophaga, retrouvées abondamment dans le biofilm, assimilent le méthanol sous conditions anoxiques (absence d'oxygène et présence de nitrate). Les espèces bactériennes affiliées à Methylophaga étaient jusqu'à présent caractérisées comme étant aérobies strictes. Des essais en culture pure, suite à l'isolement à partir du biofilm de deux espèces bactériennes affiliées au genre Methylophaga, ont démontré la capacité de Methylophaga sp. JAMI à croître en absence d'oxygène en réduisant le nitrate en nitrite. Ceci est la première démonstration directe que des bactéries du genre Methylophaga peuvent être adaptées à des environnements anaérobies. L'analyse des gènes de dénitrification sur l'ADN extrait de Methylophaga sp. JAMI nous a permis de détecter la présence de deux gènes (narGJ et narG2) codant pour la nitrate réductase membranaire (narG). L'analyse des séquences des gènes narG suggère qu'un de ces deux gènes a été acquis par transfert horizontal de gènes. Lors de ce volet du projet, des travaux ont également été menés afin de mettre au point une méthode originale de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse permettant de confirmer le marquage de l'ADN lors des essais SIP. L'autre volet de ce projet était d'identifier les populations bactériennes responsables de 1'activité de dénitrification dans le biofilm. Une approche combinant différentes techniques de biologie moléculaire a permis de dresser un portrait plus complet de la dynamique fonctionnelle du biofilm à l'étude. Les gènes narG, napA, nirS, nirK, cnorB, qnorB et nosZ, codant pour les sous-unités catalytiques des réductases impliquées dans la dénitrification, ont été utilisés comme marqueurs de la diversité des populations dénitrifiantes. Dans un premier temps, ces gènes ont été amplifiés par PCR avec des amorces dégénérées à partir de 1'ADN extrait du biofilm, pour être ensuite clonés et séquencés. Au total, 25 gènes, tous affiliés aux Protéobacteries, ont été trouvés dont certains n'ont jamais été répertoriés auparavant dans la littérature. Parmi ceux-ci ont été retrouvés les gènes napA, nirK, cnorB et nosZ d'Hyphomicrobium sp. NL23 ainsi que les gènes narGJ et narG2 de Methylophaga sp. JAM1, deux souches isolées à partir du biofilm. Des essais de PCR quantitative ont ensuite été réalisés afin d'évaluer l'abondance des gènes narG et napA, pouvant représenter des bactéries réductrices de nitrate ou dénitrifiantes, ainsi que nirS et nirK, ciblant les populations dénitrifiantes. Les gènes retrouvés chez Hyphomicrobium sp. NL23 et Methylophaga sp. JAM1 étaient les plus abondants, la quantification des autres gènes étaient de 10 à 10000 fois moindre. Parallèlement, 1'activité des populations dénitrifiantes a été évaluée par transcription inverse couplée à la PCR sur l'ARN extrait du biofilm. Seulement l'expression de quelques gènes a été détectée dont, entre autres, narGJ de Methylophaga sp. JAM1 et nirK, cnorB et nosZ d'Hyphomicrobium sp. NL23. Ces résultats suggèrent que la souche NL23 utilise directement le nitrite présent dans le biofilm, probablement produit par les bactéries réductrices de nitrate, dont la souche JAM1, pour supporter sa croissance. Les travaux réalisés au cours de ce projet de recherche nous permettent de mieux comprendre la fonction des populations dénitrifiantes du biofilm. L'ensemble de ces résultats suggère que Methylophaga sp. JAM1 et Hyphomicrobium sp. NL23 jouent un rôle majeur dans l'activité du biofilm. D'autres études seront, cependant, nécessaires afin d'évaluer l'impact de la présence de ces populations sur les performances de dénitrification du réacteur.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Villemur, Richard
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: denitrification ; methylophaga
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 25 sept. 2013 13:59
Dernière modification: 10 nov. 2015 14:27
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/127

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