Étude structure/fonction de la xylanase a de streptomyces lividans

Roberge, Martin (1994). Étude structure/fonction de la xylanase a de streptomyces lividans Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maitrise en microbiologie appliquée, 146 p.

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Résumé

Le xylane est l'un des principaux constituants de la paroi cellulaire des plantes. ll est composé d'une chaîne principale d'unités xylose liées entres elles par des liens 6-1,4. La provenance du xylane influence la nature ainsi que la fréquence des substituants retrouvés le long du polymère, faisant du xylane un substrat complexe et très hétérogène. Les xylanases ont un potentiel industriel très élevé, entre autres, leur utilisation dans le blanchiment des pâtes à papier permettrait de diminuer grandement la charge polluante de cette industrie. Les xylanases sont classées en deux familles (F et G) selon leur séquence e~ acides aminés (Henrissat et al., 1989). La bactérie Streptomyces lividans sécrète trois xylanases différentes dont la xylanase A, qui fait partie de la famille F. Pour mieux connaître le mécanisme d'action de ce type d'enzyme, certains acides aminés, conservés parmi les xylanases de la famille F, ont été modifiés par mutagénèse dirigée (Moreau, 1993). Le but de cette étude est de produire des protéines mutantes en grande quantité chez S. lividans et de les purifier pour permettre leur caractérisation biochimique. Les gènes codant pour les protéines mutantes, D50N, W85H, N127D, E128Q, R156E, T235Y, E236Q et D270N ont tous été sous-clonés chez S. lividans pour permettre la production ainsi que la purification des enzymes. La caractérisation des enzymes consistait en "l'étude des optimums de leurs températures et pH d'hydrolyse, de leurs paramètres cinétiques(Km et Vmax) ainsi que de leur mode d'hydrolyse. Les résultats ont permis de montrer qu'aucune des mutations analysées n'affectait le mode d'action de l'enzyme au niveau du profil d'hydrolyse du xylane et du xylopentaose ainsi que dans la fréquence de clivage du xylopentaose. Aucune des mutations n'a affecté l'affmité de l'enzyme envers le xylane de bouleau, car les Km n'ont pas été modifiés. Chez le mutant D50N, on observe une baisse de thermostabilité importante de l'enzyme ainsi qu'une baisse d'activité spécifique de 27% par rapport à l'enzyme de type sauvage. L'activité spécifique de la xylanase A-W85H représente 20% de celle de l'enzyme sauvage. Cette mutation a également diminué la thermostabilité de l'enzyme et augmenté la température optimale d'hydrolyse de 5­°c. La mutation N127D a également augmenté la température optimale de 10°c. L'importance de cet acide aminé est démontrée par une baisse de 98% de l'activité spécifique lorsque l'asparagine est remplacée par un acide aspartique. Le remplacement des acides glutamiques en positions 128 et 236 par des glutamines a eu pour effet de diminuer l'activité enzymatique d'un facteur de 250 et 500, respectivement. L'analyse structurale de ces deux mutants négatifs a permis de les proposer comme résidus catalytiques essentiels de la xylanase A de S. lividans (Moreau et al., 1994c). Les mutations T235Y et D270N ont eu pour effet de diminuer l'activité spécifique de l'enzyme de 42 et 61%, respectivement. La détermination de la structure tridimensionnelle de l'enzyme à 2,6 A (Derewenda et al., 1994) a permis de confirmer le rôle des différents acides aminés en les situant par rapport au site catalytique de l'enzyme. Grâce à la structure, d'autres mutants pourront être analysés pour permettre une meilleure compréhension des xylanases.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Kluepfel, Dieter
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	08 août 2019 01:54
Dernière modification:	19 mai 2023 18:51
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/8217

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