Purification et étude de la protéine MsiK de Streptomyces lividans

Penzes, Catherine (1995). Purification et étude de la protéine MsiK de Streptomyces lividans Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 156 p.

Prévisualisation

PDF - Version publiée Télécharger (26MB) | Prévisualisation

Résumé

Le transport du xylobiose et du cellobiose chez le mutant pléiotropique, S. lividans 10-164 est défectueux. Ceci est la conséquence de la mutation au niveau du gène ms1K. Afin de faciliter la caractérisation de la protéine MsiK, codée par ce gène tns1K, un système d'expression et de purification a été mis au point chez Escherichia coli. L'objet de cette étude est donc la protéine MsiK de S. /ividans. La purification des protéines mutantes et fonctionnelles a été facilitée en amplifiant respectivement, le gène mSlK de la souche 10-164 et du plasmide piAF48, par amplification élective in vitro (PCR) dans le but d'insérer une queue de six résidus histidine à l'extrémité 5' des gènes. Les amplicons ont été clonés dans les vecteurs d'expression pT7-5 et pU702 afin de permettre une sur-expression des gènes codant les protéines chez les souches E. coli BL2l(DE3) et S. lividans 10-164, respectivement. Les protéines exprimées chez E. coli ont ensuite été purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne de résine Ni-NT A. L'expression de la protéine recombinante chez S. lividans 10-164 nous a permis de vérifier sur milieu RBB-xylane, l'effet de la queue de polyhistidine sur la protéine recombinante MsiK quant à son activité. Des zones d'éclaircissements (hydrolyse du xylane par les xylanases sécrétées dans le milieu) semblables à celle produite par la souche sauvage sont présentes autour des clones positifs. Ceci démontre donc que la queue de polyhistidine n'affecte pas l'activité de la protéine in vivo. Par la suite, des anticorps polyclonaux anti-MsiK ont été produits et des expériences de liaison d'ATP ont été réalisées. Les résultats de l'immuno détection et de liaison d'A TP faits sur des échantillons protéiques purifiés d'E. coli BL21/piAF250 et sur des extraits cellulaires de S. lividans ont révélés une protéine de 41 kDa qui confinne la masse prédite par la séquence nucléotidique. Les expériences de liaison d'ATP sont en accord avec la théorie selon laquelle la protéine mutée ne lie pas l'ATP, contrairement à la protéine fonctionnelle. De plus, le fait que la protéine MsiK recombinante soit capable de lier l' ATP in vitro démontre également que la queue de polyhistidine n'interfère pas avec l'activité de la protéine. Par ailleurs, il a aussi été démontré que la protéine MsiK recombinante tronquée, produite chezE. coli BL21/piAF249 est capable de lier l' ATP. Finalement, une réaction croisée est obtenue avec les anticorps anti-MsiK et une protéine d'environ 30 kDa chez S. lividans. La capacité de liaison d' ATP par cette protéine inconnue a aussi été vérifiée et le résultat obtenu démontre que celle-ci est capable de lier l' ATP. Ceci suggère la présence d'un second système de transport énergie-dépendant chez S. lividans.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Shareck, François
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	20 févr. 2019 16:14
Dernière modification:	19 mai 2023 15:58
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/7548

Gestion Actions (Identification requise)

Modifier la notice