Signal-directed endoplasmic reticulum and golgi exit of turnip mosaic virus 6K2 protein for replication vesicle cellulare biogenesis

Jiang, Jun (2015). Signal-directed endoplasmic reticulum and golgi exit of turnip mosaic virus 6K2 protein for replication vesicle cellulare biogenesis Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 264 p.

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Résumé

Les virus à ARN positif [ARN (+)] sont connus pour induire un remodelage des membranes intracellulaires de leurs cellules hôtes, ce qui conduit à la formation d'usines virales. Ces usines virales abritent les composantes nécessaires à la réplication du virus en soutenant la synthèse de l'ARN viral (ARNv). En général, au moins une protéine codée par l’ARNv est associée aux membranes et est responsable de ce remodelage membranaire. Cette protéine recrute d'autres protéines virales et de l'hôte pour l’assemblage du complexe de réplication dans les usines virales. Cependant, le processus de la biogenèse de ces usines virales est en grande partie inconnue.Cette thèse se concentre sur l'étude de la biogenèse des vésicules de réplication (ou usines virales) du virus de la mosaïque du navet (TuMV). Le TuMV est un membre de la famille Potyviridae. Le génome viral code pour au moins 11 protéines matures. La protéine virale, associée à la membrane, 6K2 une masse molaire de 6 kDa et déclenche des modifications membranaires qui se traduissent par la formation de vésicules de réplication. Les objectifs de ce projet étaient les suivants: 1) caractériser les déterminants moléculaires de 6K2 pour la formation de vésicules de réplication; 2) identifier les facteurs de l'hôte qui sont impliqués dans la biogenèse cellulaire de vésicules de réplication induites par 6K2; et 3) d'évaluer le rôle des déterminants moléculaires ainsi que des facteurs de l'hôte qui interagissent avec 6K2 lors de l'infection par le TuMV. Dans le premier objectif, j'ai montré qu'un motif combinatoire de 6K2 était capable d'adresser cette protéine vers la voie de sécrétion pour la biogenèse des vésicules de réplication. Grâce à l'utilisation de mutagenèse dirigée et d'imagerie de cellules vivantes, j'ai trouvé que l’extrémité N-terminale de 6K2 contenait un motif d'exportation du réticulum endoplasmique (RE). La suppression de ce motif a abouti à la rétention de la protéine 6K2 dans le RE. En outre, j'ai trouvé qu'un motif GXXXG dans le domaine transmembranaire de 6K2 (TMD) était nécessaire pour la sortie des vésicules de réplication de l'appareil de Golgi. La mutation de ce motif a provoqué une rétention de ces vésicules dans l'appareil de Golgi et les a empêchées d'atteindre les chloroplastes.Dans le second objectif, l'un des facteurs de l'hôte identifié est Sec24a, une composante des coatomers COPII. L'interaction 6K2-Sec24a a été validée par des expériences de double hybride dans la levure et de co-immunoprécipitation. La protéine Sec24a a été mutée (R693K) au niveau du site de liaison B permettant la reconnaissance de la protéine cargo. Cette dernière a perdu toute capacité d'interaction avec la protéine 6K2. En outre, l’extrémité N-terminale de 6K2 s'est avérée suffisante pour l'interaction avec Sec24a. Ces résultats indiquent que Sec24a interagit avec la protéine 6K2. D'autres protéines de l'hôte ont aussi été identifiées comme étant capables d'interagir avec 6K2. Ces dernières sont des protéines SNARE de l'appareil de Golgi: Bet11, Gos11 et Vamp714. Dans le troisième objectif, le motif d'exportation du RE de 6K2 et le motif GXXXG d'exportation de l'appareil de Golgi se sont révélés être importants pour l'infection virale. Lorsque le tryptophane dans le motif d’exportation du RE a été remplacé par une alanine, le taux de réplication du virus muté (TuMVW15A) a été réduit d'environ 60%. Plus important encore, le mouvement viral de cellule à cellule a été complètement aboli. Ces résultats indiquent que ce motif est nécessaire à la fois pour la réplication du virus et son mouvement. De même, pour le virus muté au niveau du motif GXXXG (TuMVGV) la réplication a été affectée de façon importante. L'importance de l'interaction 6K2-Sec24a a été évaluée en infectant la lignée G92 d’Arabidopsis thaliana. Cette lignée comporte une mutation dans la protéine Sec24a, le résidu Arginine en position 693 étant changé pour un résidu Lysine (Sec24aR693K). Par rapport à la plante de type sauvage, un retard de l'infection par le virus a été observé. Dans le cas des protéines SNARE, des plantes knock-out pour certaines protéines SNARE du Golgi étudiées sont plus susceptibles à l'infection par le TuMV. Ce résultat a été confirmé en co-exprimant le virus avec les mutants dominants négatifs des SNARE étudiées. Ces résultats suggèrent que l'interaction 6K2-Sec24a est nécessaire, tandis que l'interaction 6K2-Golgi SNARE joue un rôle négatif au cours de l'infection par le virus. Pris ensemble, ces travaux ont fourni une meilleure compréhension de la biogenèse cellulaire des vésicules de réplication du TuMV.

Positive-stranded RNA [(+) RNA] viruses are known to induce extensive intracellular membrane remodeling, which leads to the formation of viral factories. These viral factories house virus replication components, supporting the synthesis of viral RNA (vRNA). In general, at least one membrane-associated viral protein encoded by the vRNA is responsible for membrane remodeling and hijacks other viral and host proteins for the construction of viral factories. However, the cellular biogenesis of these viral factories is largely unknown. This thesis investigates the cellular biogenesis of Turnip mosaic virus (TuMV) replication vesicles (or viral factories). TuMV is a member of the family Potyviridae. The viral genome encodes at least 11 mature proteins. The membrane-associated viral protein 6K2, which has a molecular weight of 6 kDa, is the viral protein that triggers membrane modification that results in the formation of replication vesicles. The aims of this project were to: 1) characterize the molecular determinants of 6K2 for the formation of replication vesicles; 2) identify host factors that are involved in the cellular biogenesis of 6K2-induced replication vesicles; and 3) evaluate the role of the molecular determinants and the interacting host factors for TuMV infection.In the first aim, I showed that a combinatorial motif of 6K2 was able to direct this protein to follow the early secretory pathway for the biogenesis of replication vesicles. Using site-directed mutagenesis and live cell imaging, I found that the 6K2 N-terminal tail contains a tryptophan-based endoplasmic reticulum (ER) export motif. The deletion of this motif resulted in the ER retention of 6K2. Additionally, I found that the 6K2 transmembrane domain (TMD) GXXXG motif was required for Golgi exit of 6K2-induced replication vesicles. The mutation of this motif caused Golgi retention of the replication vesicle, and was further prevented from reaching the chloroplasts.In the second aim, one of the identified host factors is the coat protein complex II (COPII) coatomer Sec24a. The 6K2-Sec24a interaction was validated by yeast twohybrid and co-immunoprecipitation experiments. The Sec24aR693K, where the cargo protein recognition B-binding site is mutated, did not interact with the 6K2 protein. Furthermore, the 6K2 N-terminal tail was enough to mediate its interaction with Sec24a. These results indicate that Sec24a is an interactor of protein 6K2. Other host protein interactors of 6K2 are the Golgi SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment protein receptors) Bet11, Gos11 and Vamp714. In the third aim, the characterized tryptophan-based ER export motif and the GXXXG Golgi exit motif were shown to be important for virus infection. When the tryptophan was replaced with alanine, the replication level of the mutated virus (TuMVW15A) was decreased about 60%. More significantly, the virus cell-to-cell movement was completely abolished. These results indicate that the tryptophan-based motif is required for both the virus replication and movement. Similarly, TuMV replication was affected dramatically when the GXXXG motif was mutated.The importance of the 6K2-Sec24a interaction was assessed by infecting G92 Arabidopsis thaliana plants, which contain a mutated Sec24a, the Arginine residue at position 693 being changed for a Lysine residue. Compared to the wild type plant, a delayed virus infection was observed. On the contrary, Golgi SNARE knockout plants showed an enhanced susceptibility to TuMV infection. This result was confirmed by coexpressing the virus with Golgi SNARE dominant negative proteins. These results suggest the 6K2-Sec24a interaction is necessary for virus infection, while the 6K2-Golgi SNARE interaction plays a negative role during virus infection. Taken together, this work provides a better understanding of the cellular biogenesis of TuMV replication vesicles.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Laliberté, Jean-François
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Zheng, Huanquan (Université McGill)
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	29 avr. 2018 05:33
Dernière modification:	04 mai 2023 18:03
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/6761

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