L'implication de l'autophagie dans l'infection par le virus de l'hépatite C

Fahmy, Ahmed Mohamed (2017). L'implication de l'autophagie dans l'infection par le virus de l'hépatite C Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 204 p.

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Résumé

L'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) est un problème majeur de santé publique avec plus de deux cent millions d’individus chroniquement infectés dans le monde. Malgré le développement d'antiviraux très puissants à action directe (AAD) pour le traitement de l'infection chronique par le VHC, il reste encore de nombreux cas de personnes infectées. Ce nombre devrait augmenter dans les prochaines années en raison du coût élevé de ces médicaments antiviraux qui en limite l’accès et le grand nombre d'infections occultes. Bien que de nombreuses avancées majeures aient été réalisées dans la compréhension de la pathogénèse et de la réplication virale, les liens étroits entre le VHC et la cellule hôte sont encore mal compris. L'autophagie, un mécanisme cellulaire de la cellule hôte, s'est révélée être modulée par le VHC. L'autophagie est un mécanisme de dégradation cellulaire qui vise à recycler les protéines ainsi que les organites qui ne sont plus nécessaires mais également à protéger la cellule d'éventuels agents pathogènes. Nous avons montré que le VHC exploite l'autophagie pour se répliquer. Le mécanisme par lequel le VHC détourne à son avantage l'autophagie et/ou les composantes autophagiques est encore débattu. Dans une étude récente au sein de notre laboratoire, nous avons montré que l'ARN-polymérase dépendante de l'ARN du VHC (NS5B) interagit avec la protéine autophagique ATG5. De plus, dans des cellules arborant un réplicon du VHC, la protéine ATG5 colocalise avec un marqueur des usines de réplication membranaire du VHC, la protéine NS4B. Finalement, le « knock-down » d’ATG5 a permis de diminuer l'ARN du virus ainsi que les niveaux d'expressions des protéines virales. Puisque ATG5 est une composante du complexe d'élongation de l'autophagie (ATG5- 12/16L1), l'objectif principal de ce projet de recherche est d'approfondir le rôle de ATG5- 12/16L1 dans le cycle de réplication du VHC. Dans le premier article, nous avons évalué la localisation du complexe ATG5-12/16L1 dans une infection chronique in vitro. En effet, nous avons montré que les composants du complexe ATG5-12/16L1 colocalisent avec les composantes de la réplicase du VHC (NS3, NS4B, NS5A et NS5B). De plus, en utilisant la méthode de ligation de proximité « Proximity Ligation Assay» (PLA), nous avons montré, in situ, que ATG5-12 interagit avec les composantes de la réplicase du VHC. Bien que ATG16L1 colocalise avec la réplicase de VHC, aucune interaction entre ATG16L1 et la réplicase du HCV n'a été observée. Ces résultats suggèrent que l'interaction de ATG5-12/16L1 avec la réplicase virale se produit via ATG5-12 et non pas avec ATG16L1. Contrairement à nos attentes, la protéine LC3, un marqueur autophagique, n'a pas été recrutée avec le complexe d'élongation au site de réplication du VHC et aucune colocalisation des protéines virales avec sa forme active (LC3II) n’a été observée. En utilisant l'expression de dominants négatifs des protéines ATG, nous avons démontré que le conjugué ATG5-12 est nécessaire pour la réplication virale du VHC. Par ailleurs, LC3II ne semble pas impliquée dans la réplication virale. Dans le deuxième article, nous avons étendu nos travaux afin de déterminer à quelle étape du cycle de réplication du VHC, le complexe ATG5-12/16L1 est nécessaire. En utilisant la méthode de «knock-down», nous avons montré que ATG5-12/16L1 est nécessaire pour la réplication de l'ARN viral du VHC. Cependant, ATG5-12/16L1 n'est pas nécessaire pour l'entrée du virus ou pour la formation de particules virales infectieuses. En contraste, LC3 semble requise pour la traduction du génome viral au début de l’infection. En purifiant les usines de réplication du VHC, nous avons détecté les composants du complexe d'élongation par immuno-buvardage de type western. Par contre, tel qu’anticipé, la protéine LC3 n’a pas été détecté dans ces échantillons. Nous avons également montré que la diminution de l'expression d’ATG12 ou ATG7 est associée à l'agrégation subcellulaire des protéines de la réplicase du VHC. L'analyse en microscopie électronique a révélé une diminution drastique du nombre et de la taille des vésicules à double membranes qui sont des composantes majeures des usines de réplication membranaire du VHC. Finalement, nous avons démontré une disparition complète des vésicules multi-membranaires dans ces mêmes usines de réplication en contexte de « knock-down » d’ATG12. En conclusion, l'ensemble de ces résultats ont mis en évidence un nouveau rôle pour le complexe ATG5-12/16L1 dans la réplication du génome et dans la formation des usines de réplication membranaire du VHC.

Hepatitis C virus (HCV) infection is a major health problem that accounts for around 200 million chronic infections worldwide. Albeit the development and approval of highly potent direct acting antivirals (DAAs) for the treatment of HCV infection, the burden of HCV infection remains and is expected to increase in the coming years due to the high cost of these drugs, the limited accessibility to the treatment, and the large number of occult infections. Even though, major breakthroughs have been achieved in the understanding of viral pathogenesis and replication, the tight link between HCV and host cell is still poorly understood. One host mechanism that has been shown to be modulated by HCV is autophagy. Autophagy is a cellular degradation mechanism that functions in the recycling of unwanted cellular proteins and organelles and to protect the cell from invading pathogens. Uniquely, HCV was shown to exploit autophagy for the purpose of viral replication. The mechanism by which HCV usurps autophagy and/or autophagic components is widely argued. In a previous report, our lab revealed that HCV RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) interacts with the autophagy protein ATG5. Furthermore, ATG5 colocalized with the HCV NS4B, a viral nonstructural protein that is associated with the HCV-induced membranous web (MW), in HCV replicon cells. Silencing of ATG5 has been shown to attenuate HCV RNA and proteins level. Since ATG5 is one component of what is called the autophagy elongation complex (ATG5-12/16L1), the main objective of this research project was to further investigate the role of ATG5-12/16L1 in HCV replication cycle. In the first article, we assessed the localization of ATG5-12/16L1 complex in chronically infected cells. Clearly, ATG5-12/16L1 components colocalized with HCV viral replicase (NS3, NS4B, NS5A, and NS5B). In addition, we showed that ATG5-12 interacts in situ with HCV replicase components by using proximity ligation assay (PLA). Although ATG16L1 colocalized with HCV replicase, no interaction between ATG16L1 and the HCV replicase was observed suggesting that the interaction of ATG5-12/16L1 with viral replicase occurs via ATG5-12 but not ATG16L1. Surprisingly, LC3 was not recruited along with the elongation complex to the site of HCV replication and no colocalization of LC3-II with HCV proteins was observed. By using dominant negative forms of ATG proteins, we demonstrated that ATG5-12 conjugate, but not LC3-II formation, was vital for HCV replication. In the second article, we extended our research to investigate at which stage of HCV replication cycle the ATG5-12/16L1 was required. By using siRNA approach, we showed that ATG5-12/16L1 was required for HCV RNA replication but not HCV entry or infectious virus particle formation. In contrast, LC3 was required only for the onset of HCV genome translation. By isolating HCV-induced membranous web, we were able to detect the elongation complex component by using western blotting whereas LC3 was undetectable in the isolated membranes. Interestingly, we revealed that silencing of ATG12 or ATG7, but not LC3, has led to subcellular aggregation of the HCV replicase proteins. Electron microscopy analysis has revealed a dramatic decrease in number and size of double membrane vesicles, a major component of HCV MW, and a complete disappearance of multimembrane vesicles from the MW composition upon ATG12 silencing. In conclusion, the results represented in this thesis highlights a novel role of the ATG5- 12/16L1 in HCV genome replication and the formation of HCV MW.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Labonté, Patrick
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	16 juin 2017 18:36
Dernière modification:	04 mai 2023 14:08
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/5270

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