Rôle du système de transport du phosphate Pst et du régulon Pho dans la virulence de la souche E. coli uropathogène CFT073

Crépin, Sébastien (2012). Rôle du système de transport du phosphate Pst et du régulon Pho dans la virulence de la souche E. coli uropathogène CFT073 Thèse. Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 235 p.

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Résumé

Les souches d’Escherichia coli uropathogènes (UPEC) sont responsables des infections du tractus urinaire (UTI). Les UTI affectent annuellement des millions de personnes et sont causées, à 85 %, par E. coli. Malgré une antibiothérapie efficace, des épisodes de résistance aux traitements, de récurrence et de persistance sont de plus en plus communs. Aussi, en raison de l’utilisation massive des antibiotiques, les souches bactériennes y sont de plus en plus résistantes. L’opéron pstSCAB-phoU code pour le système de transport spécifique du phosphate (système Pst) et fait partie du régulon Pho. Ce régulon est contrôlé par le système de régulation à deux composants PhoBR, où PhoR code la protéine senseur membranaire et PhoB la protéine régulatrice cytoplasmique. Donc, en condition de carence en phosphate, PhoBR s’active et induit l’expression des gènes du régulon Pho qui regroupe un ensemble de gènes impliqués dans l’acquisition de diverses sources de phosphate, dont la phosphatase alcaline PhoA et le système Pst. En plus d’être impliqué dans le transport du phosphate, le système Pst régule négativement PhoBR puisque son inactivation l’induit constitutivement. Ainsi, la délétion du système Pst mime un état de carence en phosphate puisque le régulon est constitutivement activé. En plus de son rôle régulationnel et de transport, le système Pst est requis pour la virulence des souches bactériennes pathogènes. Par contre, les mécanismes moléculaires reliant ce système de transport et la virulence ne sont pas encore clairement définis. Précédemment, des analyses de biopuces à ADN chez un mutant pst d’une souche d’E. coli aviaire ont montré que l’expression des fimbriae de type 1 est réprimée chez ce mutant. Étant donné que ces fimbriae sont essentiels à la virulence des souches UPEC, nous avons donc caractérisé le rôle du système Pst dans la virulence de la souche UPEC CFT073 et plus précisément, son rôle dans la régulation de l’expression des fimbriae de type 1. Dans un premier temps, nous observons que la délétion du système Pst diminue significativement la capacité du mutant pst à coloniser le tractus urinaire murin. De plus, l’atténuation de virulence du mutant pst est concomitante avec la répression de l’expression des fimbriae de type 1. Cette répression est la conséquence de l’expression différentielle des régulateurs de ces fimbriae, soit les recombinases fimB, fimE, ipuA et ipbA. En exprimant constitutivement les fimbriae de type 1 chez le mutant pst, nous observons une restauration de virulence dans le modèle murin d’UTI, montrant ainsi que l’atténuation de virulence observée chez le mutant pst est majoritairement causée par la répression des fimbriae de type 1. Deuxièmement, nous avons voulu identifier les mécanismes moléculaires reliant le système Pst et les fimbriae de type 1. Pour ce faire, une banque de mutants à l’aide du transposon aléatoire Tn10 a été construite chez le mutant pst. Les mutants obtenus ont par la suite été criblés pour une restauration de l’expression des fimbriae de type 1. Nous avons démontré que YaiC, impliquée dans la biosynthèse du c-di-GMP, relie le système Pst et les fimbriae de type 1. Ainsi, nous observons que yaiC est induit chez le mutant pst et que cette induction réprime l’expression des recombinases ipuA et ipbA et par conséquent, réprime l’expression des fimbriae de type 1. De plus, l’inactivation de yaiC, chez le mutant pst, rétabli la virulence du mutant pst. Du point de vue moléculaire, nous observons que yaiC est directement et positivement régulé par PhoB, le régulateur du régulon Pho. Finalement, puisque YaiC est impliqué dans la biosynthèse du c-di-GMP, nous avons déterminé que l’accumulation de cette molécule est concomitante avec la répression des fimbriae de type 1 chez le mutant pst. En dernier lieu, nous avons adapté et développé une méthode simple de complémentation simple-copie dans le chromosome à l’aide du transposon Tn7 afin de prévenir la perte des vecteurs de complémentation in vivo, causée par une absence de pression de sélection. À l’aide de cette procédure, nous avons adéquatement complémenté la délétion du système pst puisque tous les phénotypes de la souche sauvage sont regagnés chez la souche complémentée. De plus, l’intégration chromosomique ne requiert aucune pression de sélection. Finalement, en plus des souches pathogènes d’E. coli, cette procédure fonctionne très bien chez Salmonella enterica serovars Typhimurium et Typhi, Klebsiella pneumoniae, Cronobacter sakazakii et Citrobacter rodentium. Ainsi, dans ce projet de thèse, nous avons déterminé un lien direct entre le système Pst et la virulence. Ainsi, l’atténuation de virulence observée chez le mutant pst est causée par la répression des fimbriae de type 1 qui elle, est reliée à l’expression différentielle de ses régulateurs (fimB, fimE, ipuA et ipbA), à l’induction de yaiC et à l’accumulation du c-di-GMP. ________________________________________________________ Uropathogenic E. coli (UPEC) strains are responsible for urinary tract infections (UTI). They cause up to 85% of all UTI recorded and they annually affect millions of persons. Despite an appropriate antibiotic therapy, episodes of resistance, recurrence and persistence are common. Also, as antibiotics are massively used, pathogenic strains are increasingly resistant. The pstSCAB-phoU operon encodes the Phosphate specific transport system (Pst) and belongs to the Pho regulon, which encodes genes involved in phosphate acquisition and metabolism. Our group, and others, have determined that the Pst system is required for virulence in pathogenic strains. However, the molecular mechanisms connecting the Pst system, the Pho regulon, and virulence are not well defined. We previously identified, by microarray experiments, that inactivation of the pst mutant down-regulated type 1 fimbriae in the Avian Pathogenic E. coli (APEC) 7122 pst mutant. As these fimbriae are essential for virulence in UPEC strains, we then characterized the role of the Pst system in virulence of the UPEC strain CFT073, especially its role in the regulation of type 1 fimbriae. Firstly, we observed that inactivation of the pst system decreased virulence in the urinary tract infection (UTI) mouse model. Indeed, the pst mutant was severely attenuated in its capacity to colonize the bladder and kidneys. Also, this attenuation is concomitant with the down-regulation of type 1 fimbriae. This down-regulation is directly the consequence of the differential expression of fimB, fimE, ipuA and ipbA, which regulate expression of type 1 fimbriae. By constitutively activating the expression of type 1 fimbriae in the pst mutant, restoration of the virulence in the UTI mouse model was observed, showing that the attenuation of the pst mutant is mainly due to the down-regulation of the type 1 fimbriae. Secondly, we wanted to identify the molecular mechanisms connecting the Pst system, the Pho regulon, and type 1 fimbriae. To address this, a transposon library was constructed in the pst mutant and clones were screened for restoration in type 1 fimbriae production. Among them, the diguanylate cyclase encoding gene yaiC (adrA) connected the Pst system and type 1 fimbriae. Therefore, in the pst mutant, yaiC was induced and its induction decreased expression of type 1 fimbriae by predominantly altering expression of the ipuA and ipbA regulators. In the pst mutant, inactivation of yaiC restored the virulence of the pst mutant. Interestingly, expression of yaiC was directly and positively regulated by PhoB since transcription of yaiC depended on the promoter of phoA, a Pho regulon member. As YaiC is involved in c-di-GMP biosynthesis, an increased accumulation of c-di-GMP was observed in the pst mutant and was concomitant with the down-regulation of type 1 fimbriae. Lastly, due to the loss of complementation vectors in vivo, in the absence of selective-pressure, we adapted and developed a simple single-copy chromosomal complementation procedure. This approach used the Tn7 transposon which integrates at the chromosomal site-specific attTn7 site located in the transcriptional terminal loop of glmS. Using this procedure, we successfully complemented the pst mutant as all the phenotypes, i.e. virulence, expression of type 1 fimbriae, adhesion and invasion of bladder cells, etc., of the WT strain were restored in the pst complemented strain. Furthermore, as complementation occurs by insertion into the chromosome, use of antibiotics is not required as Tn7-mediated integration is quite stable. Finally, this approach is also efficient in other Enterobacteriacaea species as Tn7 properly integrates at the attTn7 site of pathogenic E. coli (UPEC CFT073 and 536, APEC 7122 and EHEC EDL933), Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Cronobacter sakazakii and Citrobacter rodentium. Thereby, in this project, we determined the connection between the Pst system, the Pho regulon, and the virulence of a UPEC strain. Attenuation observed in the pst mutant was mainly due to the down-regulation of type 1 fimbriae, through the differential expression of the recombinase encoding genes fimB, fimE, ipuA and ipbA, induction of yaiC and accumulation of c-di-GMP.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Dozois, Charles M.
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Harel, Josée (Faculté de Médecine Vétérinaire, Université de Montréal)
Mots-clés libres:	escherichia
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	09 nov. 2015 19:13
Dernière modification:	09 nov. 2015 19:13
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/521

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