Développement des sondes photosensibles pour le marquage régio-spécifique du récepteur NPR-A bovin.

Coupal, Martin (1998). Développement des sondes photosensibles pour le marquage régio-spécifique du récepteur NPR-A bovin. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en science, 116 p.

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Résumé

Dans le but de mieux cerner la dynamique des interactions existant entre les peptides Dnatriurétiques et le récepteur natriurétique de type-A, nous avons procédé à des études systhématiques de photomarquage de haute affinité avec le benzophénone comme agent photoactivable, et l'analogue chimérique de haute affinité [N,C,rANP(1-28)]pBNP32 (identifié comme le pBNP1) (Mimeault et al., 1993, Mol. Pharmacol. 43, 775-782), comme gabarit de synthèse. Au total, huit sondes ont été synthétisées sur support solide par chimie Boe/BOP. Les sondes [Na-p-benzoylbenzoyl, L2Y]pBNP1 (A), ainsi que [Na-p-benzoylbenzoyl, L18Y]pBNP1 (B), ont été développées de façon à incorporer l'agent benzophénone directement en~. avec pour objectif d'étudier une interaction possible entre le segment exocyclique situé en amino-terminal de l' ANP, et le site de reconnaissance du récepteur NPR-A. Dans les deux cas, le BOP a été utilisé comme agent de couplage de l'acide p-benzoylbenzoïque pour la dérivation en Na. Les sondes [L2Y, R3Bpa]pBNP1 (C), [S6Y, G9Bpa]pBNPl (D), et [Gl6Bpa, L18Y]pBNPl (E), ont été synthétisées de façon à incorporer l'agent benzophénone à l'intérieur du cycle de l'ANP, tandis que les sondes [Ll8Bpa, F26Y]pBNP1 (F), [L18Y, F26Bpa]pBNPl (G), et [Ll8Y, Y28Bpa]pBNP1 (H), ont été développées de façon à inc~rporer,_ l'age,nt benzophénone dans le segment exocyclique situé en carboxy-terminal. Dans tous les cas, l'agent photosensible a été incorporé via l'utilisation de l'acide aminé modifié p-benzoylL- phénylalanine. Les potentiels de liaison ont été évalués sur des préparations membranaires de cortex de glande surrénale de boeuf. Sous leur forme linéaire, tous les peptides ont démontré une faible affinité. À l'inverse, les analogues cycliques pBNPl-A, -B, -C, -F, -0, et -H ont enregistré des affinités statistiquement équivalentes à celle démontrée par l'ANP (~pK; :de -0.04 à +0.14), alors que pBNPl-D (~pK;= -0.43 ± 0.10) a enregistré une affinité 3 fois moindre. Considérant sa faible affinité, pBNP1-E (~ pK;= -1.76 ± 0.08) a été rejeté comme sonde potentielle. L'iodation des analogues via l'utilisation de la lactoperoxydase s'est caractérisée par l'iodation préférentielle du résidu Ty?8 • De l'incorporation du benzophénone au nivèau du segment N-terminal (pBNPl-A, -B, -C) ont découlé les sondes affichant les plus importants taux de liaison non spécifique, situés à 34%, 22%, et 20%, respectivement, alors que des substitutions faites à l'intérieur du cycle (pBNP1-E, -F), et dans le segment exocyclique C-terminal (pBNP1-G, -H), ont decoulé des sondes affichant des taux de liaison non-spécifique situés à 15%, 14%, 7%, et 6%, respectivement. Les sondes 1251-pBNP1-A, -B, -C, -F, -G, et -H ont toutes marqué de façon spécifique le récepteur NPR-A monomérique (130 kDa). Au contraire, 1251-pBNP1-E s'est montré incapable de toute incorporation. Les taux maximum d'incorporation ont été mesurés à 18%, 41%, 6%, 25%, 40%, et 40%, pour 1251-pBNP1-A, -B, -C, -F, -G, et -H, respectivement. La digestion du complexe obtenu par le photomarquage du récepteur avec chacune des sondes a révélé deux motifs distincts en SDS-PAGE, avec 1251-pBNP1-A, -B, -C, -G, et -H, affichant une bande majeure à 16 kDa, et des bandes additionnelles à 40, 34, 13, et 4 kDa, alors que le motif obtenu avec pBNP1-F n'a affiché que deux bandes, une majeure à 4 kDa, et une mineure à 40 kDa. La réduction et l'alkylation de ce fragment de 4 kDa, et son analyse subséquente par 16T6C SDS-PAGE a révélé une bande de poids moléculaire supérieure à celle obtenue par la migration de la sonde réduite et alkylée, mais non complexée au récepteur. Ces résultats suggèrent la présence d'un nouveau point de contact entre les peptides natriurétiques et le récepteur NPR-A.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Fournier, Alain
Co-directeurs de mémoire/thèse:	De Léan, André
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	27 mars 2017 21:05
Dernière modification:	19 mai 2023 13:57
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/4912

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