Construction d'un vecteur d'expression et de sécrétion de protéines homologues et hétérologues chez Streptomyces lividans.

Tremblay, Donald (2000). Construction d'un vecteur d'expression et de sécrétion de protéines homologues et hétérologues chez Streptomyces lividans. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 124 p.

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Résumé

Les streptomycètes peuvent être considérés comme une alternative pour la production extracellulaire de protéines recombinantes puisqu'ils possèdent un mécanisme efficace de sécrétion. Un vecteur, piAF911-A.8 dérivé de pU702, constitué du promoteur de la xylanase A et du peptide signal long muté de la cellulase A de Streptomyces lividans, permet la production de 2,35 g/L de xylanase A2. Ce haut taux de production obtenu avec ce vecteur est essentiellement lié aux propriétés de son peptide signal. En effet, celui-ci possède deux codons d'initiation de la traduction (ATG) utilisés conjointement pour la synthèse protéique et une séquence de 8 nucléotides complémentaires à l'ARNr 16S qui augmente encore le niveau de traduction. Cette construction a été utilisée pour la production de protéines homologues et hétérologues. Comme les manipulations génétiques chez les streptomycètes sont plus difficiles que chez Escherichia coli, des vecteurs navettes ont été construits. Ces vecteurs permettaient les manipulations rapides chez E. coli puis l'expression des gènes chez S. lividans. Un premier vecteur, pDOT7, contenant le vecteur piJ702 accompagné du vecteur pTZ19 d'E. coli a été construit. Les premières modifications apportées au vecteur ont été 1 'élimination des sites de restriction Pstl, Kpnl, Saci et EcoRJ pour l'insertion d'une cassette de clonage synthétique, puis l'insertion du promoteur de la xylanase A et du peptide signal long muté de · la cellulase A suivi du gène de la xylanase A2. Les clones contenant le vecteur pDOT7 produisent deux fois moins de xylanase que le contrôle lorsque le mycélium est ensemencé. Dans le cas de la croissance à partir des spores, seulement des traces de xylanase A sont produites. Ce résultat indique que la sporulation des clones est détrimentale pour la production de xylanase. Certains des facteurs qui auraient pu réduire la production de xylanase ont été analysés. Premièrement, pour contrer l'accumulation d'ADN simple brin chez S. lividans, le fragment Sti du vecteur piJ 101, permettant l'initiation de l'ADN double brin a été inséré dans le vecteur. Aucun changement sur la production de xylanase A à partir du vecteur navette n'a été observé. Deuxièmement, la réinsertion des sites Kpnl et Pstl, situés dans une région reconnue comme essentielle à la stabilité des plasmides n'a pas entraîné de changement dans la production. Finalement, l'élimination du site d'initiation de l'ADN simple brin présent dans la section E. coli du vecteur pTZ19 n'a eu qu'un effet restreint sur la production de xylanase A2. Ainsi, la chute de production est imputable à un élément inconnu présent dans 1 'ADN de E. coli qui provoque la réduction massive du nombre de copies des vecteurs lors de la sporulation. Le nombre de copies des vecteurs navettes passe d'environ 150 copies dénombrées dans le mycélium à seulement quelques traces dans les spores. Suite à ces résultats, il a été conclu que la construction de vecteurs qui se répliquent uniquement chez les streptomycètes est plus adéquate. Ils possèdent le gène de résistance au thiostrepton comme marqueur de sélection, le promoteur de la xylanase A, le peptide signal long muté de la cellulase A et une cassette de clonage multiple synthétique composée des sites Kpnl, Hindlll, Bgni, EcoRI, Xbal, Sphl et Pstl. De plus, divers éléments permettant la récupération rapide des protéines sécrétées ont été introduits dans les vecteurs, soit une séquence codant pour six histidines en amont (pDOT41) et en aval (pDOT42) de la cassette de clonage et le domaine de fixation à la cellulose de la cellulase B (pDOT43). La production de xylanase A à l'aide du vecteur pDOT42 a été évaluée à plus de 1 g/L. Cependant, la queue de six histidines placée en aval de la protéine n'a pas permis la récupération de la protéine. Cette queue serait éliminée par des enzymes protéolytiques probablement localisés dans le milieu de culture. > Le vecteur pDOT42 a été utilisé pour l'essai de la production de la cellulase B de S. lividans, des antigènes de 38 et 19 kDa de Mycobacterium tuberculosis, des protéines EspD et PAA d'E. coli, de la MMP9 de Mus musculus (souris) et d'un ORF de Streptococcus suis. Aucune production de la MMP9 de souris, des protéines EspD et PAA d'E. coli et de l'ORF de S. suis n'a été détectée dans les différents sumageants de culture. Le gène codant pour l'ORF de S. suis présente des séquences répétitives qui mèneraient à l'instabilité de la structure. L'absence de production de la MMP9 et des protéines EspD et PAA serait due à la présence, dans les gènes codant pour les différentes protéines, de plusieurs codons TT A rarement retrouvés chez S. lividans. Cependant, le remplacement de deux codons dans le gène de la MMP9 n'a pas mené à la production de la protéine. La production de cellulase B de S. livi dans était de 100 mg/L ce qui est l 00 fois plus élevé que les résultats obtenus antérieurement. Finalement, les protéines de 38 et 19 kDa de M tuberculosis ont été produites à des quantités supérieures à 0,5 g/L. Étant donné que ces deux antigènes sont des lipoprotéines, il fallait éliminer une cystéine voisine du site de reconnaissance de la signal peptidase pour éviter leur attachement à la membrane par une queue lipidique. Les deux protéines de M tuberculosis présentent cependant une hétérogénéité de leur N-terminal, ayant perdu 7 ou 8 acides aminés dans le cas de la protéine de 3 8 kDa et 24 ou 26 acides aminés pour la protéine de 19 kDa. Malgré une certaine protéolyse, ces résultats démontrent que S. lividans peut être un hôte efficace pour la production de grandes quantités de protéines de M tuberculosis et que le vecteur pDOT42 est utilisable pour la production de protéines homologues et hétérologues.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Morosoli, Rolf
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	28 mars 2017 19:18
Dernière modification:	21 avr. 2022 14:45
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/4885

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