Imagerie tissulaire par microscopie de seconde harmonique interférométrique.

Rivard, Maxime (2016). Imagerie tissulaire par microscopie de seconde harmonique interférométrique. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'énergie et des matériaux, 311 p.

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Résumé

La microscopie optique non linéaire est un domaine qui a beaucoup évolué dans les derniers 25 ans. Ses applications en biologie pour l’étude des tissus sont nombreuses. Dans ce domaine, la microscopie de génération de seconde harmonique (GSH) est une technique d’imagerie qui se distingue des autres par son mécanisme de contraste unique, qui permet d’imager les structures non centrosymétriques comme le collagène des tissus conjonctifs, la myosine des tissus musculaires et certains cristaux optiques non linéaires. Toutefois, la microscopie GSH ne mesure que l’irradiance du signal GSH et sa phase est perdue. Cela pose problème puisque la phase du signal GSH contient de l’information sur l’orientation des molécules non centrosymétriques dans la zone imagée. Il faut donc trouver un moyen de mesurer la phase du signal GSH pour améliorer notre interprétation des images GSH dans les tissus biologiques. Cela est possible en combinant l’interférométrie et la microscopie GSH. L’objectif de ce projet est donc de construire un microscope GSH interférométrique pour mesurer la phase relative du signal GSH dans les tissus biologiques et utiliser ces nouveaux résultats pour faire une meilleure interprétation des images obtenues en microscopie GSH dans ceux-ci. Cette thèse présente une revue historique de la microscopie, de l’optique non-linéaire et de la microscopie optique non-linéaire. La théorie de la génération de seconde harmonique y est détaillée, dans un contexte de microscopie. La structure des tissus musculaires et des tissus conjonctifs de collagène y est résumée, en mettant l’emphase sur leurs propriétés optiques non linéaires. L’histoire et la théorie de la microscopie GSH interférométrique y sont également abordées. La conversion d’un montage en microscope GSH interférométrique et le protocole à suivre pour s’en servir y sont expliqués. Finalement, les résultats de la microscopie GSH interférométrique dans un cristal de niobate de lithium périodiquement orienté (PPLN), dans un tissu musculaire et dans différents tissus de collagène y sont présentés et interprétés. Pour les tissus de collagène, les résultats des simulations réalisées dans un modèle que nous avons développé y sont également présentés et interprétés. Le microscope GSH interférométrique a permis d’imager les domaines de polarités opposées dans le cristal PPLN, dans les tissus musculaires et dans les tissus de collagène. Cela démontre que le montage fonctionne correctement et peut servir à l’imagerie des tissus biologiques. Les domaines dans les tissus musculaires sont similaires à ceux du cristal PPLN, tandis que les domaines dans les tissus de collagène font plusieurs centaines de microns de long et quelques microns à quelques dizaines de microns de large. Des images de la phase du signal GSH ont également été obtenues. Les résultats dans les muscles ont permis de mettre en évidence la bipolarité des filaments de myosine. Un modèle a été mis au point pour expliquer les résultats dans les tissus de collagène. Dans celui-ci, les fibrilles de collagène sont représentées par de longs cylindres ayant une polarité χ(2) aléatoire qui est maintenue sur toute leur longueur. Des simulations réalisées à partir de ce modèle donnent des résultats en accord avec ceux obtenus en microscopie GSH interférométrique. La combinaison de tous ces résultats a permis d’établir une corrélation entre la largeur de la distribution de la phase, le ratio de fibrilles ayant des polarités opposées dans une région donnée (ratio f ) et l’irradiance du signal GSH dans les domaines des tissus de collagène. La polarité aléatoire des fibrilles de collagène donne lieu à une structure complexe dans les tissus qui permet d’expliquer les modulations importantes du signal GSH dans la direction avant. Les longues et fines structures visibles dans les images GSH du signal avant ne sont pas des fibrilles individuelles, mais sont causées plutôt par la variation du ratio f et de l’accord de phase lorsque le point focal est déplacé dans le tissu. Les images GSH interférométrique et notre modèle permettent donc de faire une meilleure interprétation des images GSH des tissus de collagène. Finalement, certaines améliorations peuvent être apportées au montage pour augmenter la sensibilité, accélérer l’acquisition des images et obtenir la phase en temps réel. D’autres tissus biologiques, comme le cartilage (riche en collagène type II), devraient également être imagés avec cette technique. L’approximation du ratio f à partir de la largeur de la distribution de la phase dans les domaines des tissus de collagène doit être poussée plus loin.

Nonlinear optical microscopy is a field that evolved a lot in the past 25 years. It has many applications in biology for tissue imaging. Within this field, second harmonic generation (SHG) microscopy is a technique that differentiates itself from others by its unique contrast mechanism. It allows imaging of noncentrosymmetric structures such as collagen in connective tissues, myosin in muscular tissues and some crystals with nonlinear optical properties. However, SHG microscopy can only measure the intensity of the SHG signal. Its phase is lost, which is a problem since the SHG phase contains information on the orientation of the noncentrosymmetric molecules in the imaged area. A mean to measure the phase of the SHG signal must be found in order to improve our interpretation of SHG images taken in biological tissues. This can be achieved by combining interferometry and SHG microscopy. The goal of this project is to build an interferometric SHG microscope that can measure the relative SHG signal phase in biological tissues. These new results will then be used to find a more accurate interpretation of the images obtained with SHG microscopy in these tissues. This thesis contains a historical review on microscopy, on nonlinear optics and on nonlinear optical microscopy. The theory behind second harmonic generation, in the context of microscopy, is presented in details. The structure of muscle tissues and connective tissues rich in collagen are explained, with an emphasis on their nonlinear optical properties. The history and the theory behind interferometric SHG microscopy are also explained in details. The conversion of a microscope setup into an interferometric SHG microscope and the protocol that must be followed to use it are also presented in this work. Finally, this thesis presents and explains the results obtained with interferometric SHG microscopy in a periodically poled lithium niobate (PPLN) crystal, in muscular tissue and in different connective tissues rich in collagen. The results of simulations performed with a model that we developed for collagen tissues are also presented and explained. The interferometric SHG microscope provided images in which the domains with opposite polarities could clearly be identified in PPLN crystal, in muscle tissues and in various collagen tissues. This demonstrates that the setup works properly and can be used to perform imagery in biological tissues. The domains in muscle tissues are similar to those in PPLN crystal. The domains in collagen tissues can measure hundreds of microns in length and from a few microns to a few tens of microns in width. Images of the relative phase of the SHG signal in biological tissues have also been obtained. The results in muscle tissues show the bipolarity of myosin filaments. A model was developed to explain the results obtained in collagen tissues. In this model, collagen fibrils are represented by long cylinders with a random χ(2) polarity that is maintained over their whole length. Simulations based on this model provide results that are coherent with those obtained with interferometric SHG microscopy. The compilation of all these results allows to establish a correlation between the width of the phase distribution, the ratio of fibrils with opposite polarities within a region ( f ratio) and the SHG signal intensity in the domains of collagen tissues. The random polarity of collagen fibrils creates a complex structure in tissues that explains the large modulations of the SHG signal in the forward direction. The long and thin structures that can be seen in the images obtained from the forward SHG signal are not individual fibrils. They are caused by the variation of the f ratio and the phase matching when the focal spot of the laser is moved within the tissue. The interferometric SHG images and the model provide a more accurate interpretation of the images obtained with SHG microscopy in collagen tissues. Finally, the interferometric SHG microscope setup can still be improved to increase its sensitivity, to increase its image acquisition speed and to provide the SHG phase in real time. Other biological tissues, such as cartilage (rich in type II collagen), should also be studied with this technique. The approximation of the f ratio based on the width of the SHG phase distribution within the domains in collagen tissues must also be further studied.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Légaré, François
Mots-clés libres:	microscopie; seconde harmonique; GSH; interférométrie; optique non linéaire; laser; collagène; tissus biologiques; phase; polarité; tendon; fascia; muscle
Centre:	Centre Énergie Matériaux Télécommunications
Date de dépôt:	20 oct. 2016 20:00
Dernière modification:	01 oct. 2021 15:06
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/4640

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