Caractérisation de dioxygénases du biphényle produites par ingénierie génétique.

Simard, Catherine (2002). Caractérisation de dioxygénases du biphényle produites par ingénierie génétique. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 109 p.

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Résumé

Les biphényles polychlorés (BPC) sont des composés xénobiotiques introduits récemment dans l'environnement. La détection de ces produits toxiques dans la biosphère et leur accumulation dans les tissus d'organismes vivants a dévoilé la limite de notre écosystème à minéraliser ces composés. Autre que par l'intervention de techniques physico-chimique pour l'élimination de ces contaminants et qui demeurent insatisfaisants jusqu'à présent, l'utilisation de procédés de dégradation par les microorganismes est une avenue intéressante. Plusieurs microorganismes disposent d'un système enzymatique pouvant transformer certains congénères BPC, par la voie de dégradation du biphényle. Cependant, les bactéries aérobies identifiées ne transforment qu'un nombre restreint de congénères BPC essentiellement ceux à faible teneur en chlore, excluant les congénères à fort pourcentage de chlore ou de forme co-planaire. La dioxygénase du biphényle (BPDO), qui catalyse la première étape de la voie catabolique du biphényle, est déterminante dans le profil de sélection des souches capables de transformer les BPC. Par les connaissances acquises sur le mécanisme réactionnel de la BPDO, ainsi que sur ses éléments structuraux déterminants dans la spécificité de l'enzyme, il nous est possible d'établir des stratégies de sa modification génétique afm d'améliorer cette voie catabolique microbienne. L'étude présentée dans ce mémoire comporte deux volets, soit la caractérisation enzymatique d'hybrides de BPDO produits par ingénierie génétique, ainsi que la construction et de la caractérisation enzymatique de BPDO variants produits par recombinaison aléatoire (DNA shujjling) entre les BPDO des souches Burkholderia cepacia LB400 et Comamonas testosteroni 8356. Nous avons donc comparé l'activité enzymatique des BPDO parentales avec celle de BPDO hybrides dans un système in vitro, utilisant des préparations d'enzymes purifiées et dans un système in vivo utilisant des cellules E. coli exprimant ces enzymes. Ces travaux ont permis de confirmer certaines études antérieures qui mentionnaient que la portion C-terminale de la sous-unité a ainsi que la sous-unité j3 de la BPDO influençaient grandement le profil de transformation des BPC. De plus, nous avons démontré que la BPDO de LB400 est plus flexible à recevoir des modifications structurelles majeures que celle de 8356 par le maintien de l'activité enzymatique de ces hybrides. De même, nous avons identifié trois hybrides LB, LBC et LBCD comme étant capables de transformer le 33'44'-tetrachlorobiphényle encore récalcitrant. Cependant, l'ensemble de ces hybrides montre un spectre d'activité peu varié. De ce constat, nous avons donc utilisé l'évolution moléculaire in vitro par recombinaison aléatoire afm d'explorer un plus grand nombre de BPDO variantes qui pourraient présenter un potentiel catabolique plus large ou varié que ceux des BPDO identifiées jusqu'à ce jour. La stratégie a été d'appliquer la recombinaison in vitro aléatoire sur les portions du gène bphA en partie C-terminale. Cette approche a permis d'obtenir le mutant II-H intéressant par son habilité à catalyser une oxygénation en ortho­ meta favorisant une transformation efficace du congénère 2,6-dichlorobiphényle toxique et persistant dans l'evironnement.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Sylvestre, Michel
Mots-clés libres:	bpc ; biphenyle ; dioxygenase
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	30 juill. 2015 19:33
Dernière modification:	16 sept. 2015 15:32
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/2346

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