Construction de trois virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) portant des mutations dans le gène nef : contribution à l’étude du rôle de Nef dans la pathogenèse associée à l’infection virale

Sene, Jupiter (2002). Construction de trois virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) portant des mutations dans le gène nef : contribution à l’étude du rôle de Nef dans la pathogenèse associée à l’infection virale Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 180 p.

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Résumé

Le syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA) a été décrit au début des années quatre-vingt comme une maladie mortelle caractérisée par une immunodépression grave. Cette dernière est à l'origine de la vulnérabilité à un grand nombre de microorganismes pathogènes responsables de diverses infections opportunistes et de certaines formes rares de néoplasmes. Divers travaux sur le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), l'agent étiologique du SIDA, postulent l'existence d'une corrélation entre le rôle de certains gènes viraux et le développement de la maladie. Le gène nef, en particulier, a fait l'objet de nombreuses études. Malgré toutes les connaissances à date sur ses fonctions in vitro et in vivo, la corrélation entre la présence d'un gène nef défectif ou intact et la progression ou non de la maladie présente encore certaines ambiguïtés et quelques controverses. En effet, cette corrélation était basée sur le degré de compréhension de son importance dans le cycle viral et sur les effets protecteurs des vaccins vivants atténués dans le modèle animal. De plus, la faible virémie et l'absence d'évidence de progression vers le SIDA observées chez des macaques adultes ou chez des humains infectés, respectivement, par le virus de l'immunodéficience simienne (VIS) ou le VIH portant des mutations dans le gène nef suggéraient également l'implication de ce gène dans le développement de la maladie. Le principal objectif de ce travail était de construire des VIH-1 mutants pour le gène nef, permettant, à l'issue de leur caractérisation biologique, d'apporter une contribution dans 1'étude du rôle de la protéine Nef dans la cytopathogénicité, dans la cinétique de la réplication et/ou dans l'augmentation de l'infectivité virale in vitro. Les mutations dans le gène nef introduites par mutagenèse dirigée par PCR nous auront permis de produire : a) un virus potentiellement négatif pour la protéine Nef, le VIH-1 CDS1.2; b) un second virus qui n'exprime que les résidus 1-19 de la région N-terminale de la protéine Nef, le VIH-1 CDS2; etc) un dernier virus qui n'exprime que les résidus 20-206 de la protéine, le VIH-1 CDS1. Ces virus construits et caractérisés sur le plan physique et partiellement sur le plan biologique ont été réalisés de façon à pouvoir vérifier le rôle de la région N-terminale dans la cinétique de réplication virale, dans l'infectivité et dans la cytopathogénicité. De plus, l'hypothèse de l'implication du potentiel fusogénique associé à la région N-terminale dans le processus de fusion cellulaire aboutissant à la formation des vacuoles qui caractérise les effets cytopathogènes de l'infection par le VIH-1 in vitro a été étudiée. Cette étude visait à évaluer ce potentiel (antérieurement décrit et observé sur les liposomes et sur les immunosomes-Nef) dans le contexte d'une infection virale in vitro. Finalement, des essais sur le rôle de la protéine Nef recombinante fournie en trans dans la cytopathogénicité et l'infectivité du VIH-1 LAI dans les cellules CEM ont été effectués. Les résultats obtenus suggèrent l'existence d'une corrélation entre la présence des résidus 20-206 de la protéine Nef et le maintien des titres viraux à des niveaux élevés in vitro. Quant à la courte portion N-terminale formée par les résidus 1-19, elle serait plutôt impliquée dans les aspects qualitatifs et quantitatifs des effets cytopathogènes produits. La protéine recombinante Nef produite dans le système d'expression baculoviral a été purifiée sur colonne héparine-sépharose à plus de 80% d'homogénéité. Lorsque les cellules CEM ont été préalablement mises en contact avec la protéine Nef avant l'infection par le VIH-1 LAI, nous avons enregistré une augmentation du rendement en virus infectieux, en corrélation avec les effets cytopathogènes observés dans les cellules infectées. En dernière analyse, grâce à la caractérisation physique et biologique des virus mutants construits ainsi que les essais sur le rôle de la protéine Nef recombinante fournie en trans dans la cytopathogénicité et l'infectivité du VIH-1 LAI dans les cellules CEM, nous avons montré que la protéine Nef était impliquée dans la régulation de différentes étapes du cycle de la réplication du virus, dans l'augmentation de l'infectivité virale et dans la cytopathogénicité. De plus, le potentiel fusogénique de la région N-terminale semble se manifester dans l'aspect qualitatif des effets cytopathogènes produits lors d'infections des cellules CEM, en modulant le degré de la formation des syncytia et de vacuoles résultant de la mise en commun des membranes plasmiques des cellules fusionnées. Ainsi, les résultats issus de cette étude nous permettent d'appuyer l'hypothèse de l'implication de Nef dans la progression de la maladie en facilitant la réplication virale à des niveaux plus élevés. De plus, la cytotoxicité directe de Nef sur les cellules constituerait un autre mécanisme permettant d'expliquer la déplétion encore très ambiguë des lymphocytes CD4+ chez les sidéens. Donc, il demeure nécessaire et très pertinent de poursuivre les travaux sur le produit du gène nef afin de mieux cerner les propriétés de ce dernier et de mieux évaluer son implication dans la progression de la maladie, car les perspectives de développement de nouvelles stratégies de vaccins préventifs et/ou thérapeutiques chez l'humain contre l'infection par le VIH et l'évolution de la maladie mortelle induite restent encore très prometteuses.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Thibodeau, Lise
Mots-clés libres:	VIH-1 ; virus ; immunodeficience ; nef ; gene
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	16 sept. 2015 15:33
Dernière modification:	14 déc. 2015 20:08
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/2345

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