Évaluation du potentiel thérapeutique des nanocomplexes pVax-GLP-1/chitosane et de siARN-DPP4/chitosane pour le contrôle du diabète de type 2

Jean, Myriam (2010). Évaluation du potentiel thérapeutique des nanocomplexes pVax-GLP-1/chitosane et de siARN-DPP4/chitosane pour le contrôle du diabète de type 2 Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 256 p.

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Résumé

Le diabète de type 2 est une maladie métabolique qui se caractérise par une hyperglycémie chimique. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), plus de 300 millions de personnes seront atteintes du diabète d'ici l'an 2025 et cette augmentation concerne essentiellement le diabète de type 2. Devant l'accroissement alarmant d'individus atteints du diabète de type 2, il s'avère très important d'explorer de nouvelles avenues pour la mise au point de traitements, nouvelle génération, plus efficaces pour réduire les symptômes, les complications et la mortalité associée au diabète de type 2. Le GLP-1 (glucagon-like peptide 1) est un dérivé du proglucagon qui stimule la sécrétion de l'insuline et inhibe la sécrétion du glucagon, une hormone antagoniste de l'insuline. Pour normaliser les concentrations de glucose chez les personnes atteintes du diabète de type 2, le GLP-1 doit être administré de façon continue afin d'éviter l'inactivation rapide de ce dernier par l'enzyme dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV). Notre projet de recherche consistait donc à développer et à évaluer le potentiel d'une thérapie génique, dont le principe consiste à transférer le gène qui exprime la molécule GLP-1 pour traiter le diabète en utilisant le vecteur d'expression recombinant pVax-GLP-1 combiné à un polymère à base de chitosane comme système de livraison. Le chitosane est un polysaccharide naturel et biodégradable dont les propriétés biologiques sont définies par sa masse molaire moyenne (Mn) ainsi que par sen degré de désacétylation (DD) qui correspond à la fraction monomère glucosamine du polymère. Le chitosane forme instantanément des nanocomplexes• avec l'ADN et l'ARN par attraction électrostatique en condensant les acides nucléiques. Le ratio N:P correspond au ratio amide de chitosane: phosphate de l'ADN. Ainsi le plasmide recombinant pVax-GLP-1 (7-37) exprimant la forme active du GLP-1, soit le GLP-1 (7-37), et les plasmides recombinants exprimant les formes variantes du GLP-1 (7-37) soit le [Ser8-GLP-1 (7-37)] et le [Tyr9-GLP-1 (7-37)], modifiées pour accroître leur résistance à la dégradation par la DPP-IV et augmenter leur demie vie biologique, ont été complexés avec trois différentes formulations de chitosanes soit le [92-10-5, 80-10-10 et 80-80-5 (DD-Mn-N :P)] pour créer six nanocomplexes thérapeutiques pVax-GLP-1/chitosane (NCT). Ces formulations de chitosane ont été choisies en fonction de leurs propriétés inflammatoires et biodégradables (Jean et al., 2009). Nous nous sommes intéressés à l'évaluation de l'efficacité de transfection et d'expression de gènes recombinants, en utilisant des nanocomplexes composés des trois formulations de chitosane, in vitro, dans trois lignées cellulaires (les cellules hépatocytes HepG2 et les cellules du colon HT-29 et Caco-2). Nous avons démontré que la transfection des lignées cellulaires avec les nanocomplexes codant pour la luciférase et la -galactosidase a permis une augmentation de l'expression des gènes recombinant dans les cellules HepG2 (1,2 x 107 RLU/min*mg de protéine) et dans les cellules Caco-2 (1,7x107 RLU/min*mg de proté ne) relativement aux cellules traitées avec les plasmides recombinants seuls. Les tests de viabilité effectués sur les cellules HepG2, Caco-2 et HT- 29 transfectées avec les nanocomplexes pEGFPLu/chitosane ont montré que le chitosane n'a pas d'effet toxique sur les cellules in vitro. Les analyses en microscopie électronique et par diffusion dynamique de la lumière (OLS) ont démontré que les NCT pVax-G LP-1/chitosane ont une forme principalement sphérique, un diamètre variant entre 163 à 246 nm et un potentiel zêta variant de 26 rn V à 32 rnV. Nous avons également démontré que le chitosane protège plus de 70% de l'ADN recombinant contre la dégradation par des concentrations élevées de DNase 1 (2 unités/11g d'ADN). Les analyses en microscopie confocale des cellules transfectées avec les NTC ont démontré que les nanocomplexes sont internalisés dans les HepG2, 4 heures suivant leur ajout sur les cellules. Toutefois seuls NCT composés du chitosane 92-10-5, relâche la totalité du pVax-GLP-1 à l'intérieur des cellules 24 heures suivant la transfection. La quantification de l'expression du peptide GLP-1 dans les cellules HepG2 transfectées avec les NCT a montré que les NCT composés du chitosane 92-10-5 permettent une expression plus importante du GLP-1 et de ses formes variantes (30 à 120 ng/L) que les NCT composés des chitosanes 80-10-10 et 80-80-5 {10-60 ng/L). L'expression des formes variantes du GLP-1 était 4 fois plus élevée que celle du GLP-1 natif, confirmant leur protection contre la dégradation par l'enzyme DPP-IV. Nos résultats suggèrent que, in vitro, le chitosane n'est pas toxique et représente un système de livraison efficace et sécuritaire du plasmide recombinant pVax-GLP-1 permettant ainsi une expression continue du GLP-1. Dans un deuxième temps, nous avons évalué l'expression du GLP-1 et son effet sur la tolérance au glucose, in vivo, en utilisant un modèle animal diabétique (rats ZDF). Nous avons montré que l'administration des NCT aux rats diabétiques ZDF induit une augmentation de l'expression du GLP-1 d'une manière continue (35 pmol/L), ce qui confère une tolérance au glucose 2 fois plus importante que celle observée chez les rats ZDF non traités et ce, durant 29 jours suivants la fin du traitement. Ceci a été confirmé par 1 'évaluation du taux d'insuline chez les rats qui passe de 5 ng/ml à 12 ng/ml suivant le traitement avec les NCT et par 1 'évaluation de la prise de poids qui diminue de 5% chez les rats traités avec les NCT comparativement aux rats injectés avec le pVax seul. Par ailleurs, les études histologiques nous ont permis d'évaluer d'une part, le potentiel inflammatoire de chacun des NCT et d'autre part, leur cinétique de biodégradabilité. Ainsi, les NTC pVax-GLP-1/92-1 0-5, suite à leur administration, se sont avérés peu inflammatoires et leur dégradation était complétée en environ 1 jour comparativement aux NCT pVax-GLP-1180-10-10 et 80-80-5. Ces derniers étaient moins biodégradables et ont suscité une plus grande mobilisation des leucocytes aux sites d'injections. Ces résultats révèlent, pour la première fois, que les NTC composés du chitosane 92-10-5 seraient les candidats potentiels pour livrer de façon continue, in vivo, la protéine recombinante GLP-1 à des fins thérapeutiques tout en évitant une réponse immunitaire qui pourrait être néfaste pour l'organisme et nuisible pour le traitement du diabète de type 2. Parallèlement, nous avons développé d'autres NCT composés d 'ARN interférents (siARN) dirigés contre I'ARNm du gène DPP-IV et complexés aux 3 différentes formulations de chitosane soit le 92-10-5, 80-10-10 ou 80-80-5 (% DO, Mn, ratio N : P). Ces NCT (siARN-DPP4/chitosane) ont été conçus afin de diminuer l'expression in vitro de la DPP-IV responsable de la dégradation du GLP-1. Les analyses par microscopie électronique et par diffusion dynamique de la lumière (OLS) ont démontré que les nanocomplexes ODN-DPP4/chitosane produits sont sphériques et homogènes, ils ont un diamètre de 71 à Ill nm et un potentiel zêta variant de 16 mV à 20 mV. Des analyses, in vitro, des cellules HepG2 transfectées avec les nanocomplexes ODN-DPP4/chitosane, en microscopie confocale ont démontrées que les nanocomplexes ODN-DPP4/chitosane sont intemalisés 1 heure suite à la transfection des cellules alors que les ODN sont relâchés du chitosane à partir de 2 jusqu'à 30 heures suivant la transfection. Nous avons également démontré, par des tests enzymatiques, que l'utilisation de NCT (siARN-DPP4/chitosane) permet de réduire jusqu'à 50% l'expression de l'enzyme DPP-IV dans les cellules HepG2 et Caco-2. Ces résultats, ont été confirmés par la quantification du niveau d'expression de la DPP-IV par qRT-PCR et qui a montré que la transfection des cellules HepG2 avec les NCT (siARN-DPP4/chitosane) entraîne une inhibition de l'expression du gène DPP-IV de l'ordre de 65%. En conclusion, au cours de ce projet nous avons mis au point et ce, pour la première fois, des NCT (pVax-GLP-IIchitosane) qui expriment le GLP-1 sous sa forme active qui agit en stimulant la sécrétion d'insuline, en diminuant la prise de poids et en conférant une meilleure tolérance au glucose chez les rats diabétiques. Ces NCT constituent un matériel novateur très important dans le développement d'une thérapie génique pour le traitement efficace du diabète de type 2. Parallèlement, nous avons démontré le potentiel des NCT (siARN-DPP4/chitosane) capable de réduire, in vitro, l'expression de l'enzyme DPP-IV responsable de l'inactivation du GLP-1. Ainsi, nos travaux montrent le potentiel des NTC pVax-GLP-1/chitosane qui pourront être utilisés en thérapie génique seuls ou combinés aux NCT (siARN-DPP4/chitosane) pour le traitement du diabète de type 2.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Merzouki, Abderrazzak
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Guertin, Claude
Mots-clés libres:	therapie ; gene
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	13 févr. 2013 19:10
Dernière modification:	11 nov. 2015 15:18
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/223

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