Protocole pour dénombrer deux bactéries Gram positif, Lactobacillus johnsonii et Bifidobacterium adolescentis, par la technique classique de culture et par hybridation in situ combinée à la cytométrie de flux.

Hajj-Mohamad, Mariam (2003). Protocole pour dénombrer deux bactéries Gram positif, Lactobacillus johnsonii et Bifidobacterium adolescentis, par la technique classique de culture et par hybridation in situ combinée à la cytométrie de flux. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 172 p.

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Résumé

Grâce à des expériences nombreuses et riches d'informations révélatrices, le voile est en voie d'être levé sur l'effet qu'ont les bactéries endogènes, Lactobacillus et Bifidobacterium sur le système digestif. On peut désormais leur attribuer un rôle indéniable, bénétique pour la santé humaine. Cependant, Lactobaciffus johnsonii et Bifidobacterium adolescentis sont deux bactéries symbiotiques de la microtlore gastro­ intestinale endogène de l'hQmme. La colonisation de l'intestin s'effectue dans les heures qui suivent la naissance, et se poursuit toute la vie. Elles sont présentes en grandes quantités (entre 108 et 10 11 bactéries/g de matière colique) et sont considérées comme dominantes parmi plus de 400 espèces bactériennes qui composent la microtlore du côlon. Ces deux bactéries jouent un rôle très important pour la santé humaine en aidant notamment à la digestion des aliments, en synthétisant des vitamines essentielles et en prévenant la prolifération des pathogènes. Elles ont également plusieurs vertus probiotiques potentielles, en particulier des etTets anti-microbiens, immunomodulateurs, de réduction du risque de cancer, et elles intluencent 1 'équilibre de la microflore intestinale une fois ingérées en quantité sutlisante. Les lactobacilles et les bitidobactéries sont les plus utilisées comme probiotiques dans les aliments fonctionnels à cause de leur capacité de survie élevée durant leur passage le long du tube digestif. De plus, ce sont des bactéries lactiques qui sont utilisées en alimentation humaine et sont à la base de la fabrication des produits laitiers, camés, végétaux et de la pêche. Elles sont également utilisées comme perspectives biofonctionnelles dans les produits pharmaceutiques pour une thérapie probiotique. Afin d'estimer les variations des populations de Lactobacillus et Bifidobacterium avec 1 'état sanitaire de 1' Homme et de connaître quels sont les dosages de probiotiques les mieux adaptés à chacune des pathologies, le dénombrement de ces bactéries se révèle comme un paramètre important à étudier. Vue leur importance en santé et en maladie des êtres humains, l'étude de ces bactéries a été le sujet de centaines d'articles publiés depuis Pasteur (1885) qui estimait que la vie est impossible sans bactéries. Mais leur étude nécessite des outils d'investigation très spécifiques et se heurte à de nombreux obstacles méthodologiques et par suite leur connaissance reste restreinte. Certains chercheurs ont développé des milieux de culture spécifiques. Or ces milieux, soit qu'ils inhibent partiellement les souches étudiées, soit ils sont insuffisamment sélectifs, soit qu'ils ne sont pas adaptés à l'emploi dans un laboratoire de routine car leur préparation est fastidieuse, soit qu'ils sont complexes par utilisation, par exemple, des antibiotiques, des agents inhibiteurs et des sangs humain et animal. D'autres chercheurs ont utilisé les techniques modernes de biologie moléculaire dont l'amplification par PCR, PCR-DGGE et la technique de l'hybridation in situ de sondes couplées à un fluorochrome (FJSH). Plus récemment, la cytométrie de flux est utilisée pour dénombrer et détecter les bactéries vivantes. Les objectifs de ce travail étaient en premier lieu de développer un milieu de culture sélectif simple qui favorise la croissance de Bifidobacterium adolescentis et inhibe la croissance de Lactobacillus jolmsonii, et d'en etfectuer une étude comparative de la croissance sur d'autres milieux électifs; en second lieu de détecter et dénombrer ces deux souches bactériennes de type Gram positif par hybridation in situ en combinaison avec la cytométrie de flux (FISH-FCM). Dans ce projet de recherche, nous avons utilisé des milieux de culture, MRS+++ comme milieu électif pour Lactobacillus jolmsonii et Bifidobacterium adolescentis, et MRSLC, développé dans cette étude, comme milieu sélectif et reproductif pour B. adolescentis dont le chlorure de lithium est l'agent inhibiteur. Ce milieu est simple en comparaison avec les autres milieux publiés dans la littérature. La croissance de la souche Bifidobacterium adolescentis sur MRSLC a été comparée avec sa croissance sur un autre milieu électif MRS+++. L'utilisation de ces milieux nous permet d'obtenir des informations sur la présence et l'abondance des microorganismes d'intérêt. Ce sont des milieux simples, faciles à préparer et, dont le temps de croissance est de 24 heures. Puisque le temps est un facteur critique, une nouvelle technique a été optimisée pour contourner l'étape de culture afin d'effectuer des analyses à haute vitesse, multiparamétriques et automatisées. La technique de l'hybridation in situ en combinaison avec la cytométrie de flux (FISH-FCM) a été utilisée pour la première fois afin de détecter ces deux bactéries à Gram positif de la microflore gastro-intestinale en cultures pures. L'utilisation de la technique d'hybridation in situ combinée à la cytométrie de flux a permis de détecter avantageusement les deux bactéries de type Gram positif L. johnsonii et B. adolescentis en culture pure. Cette technique optimisée est basée sur la fixation à la paraformaldéhyde 3% pendant 16 heures, la perméabilisation à l'alcool 50%, la dispersion des cellules par l'utilisation du pyrophosphate et de la sonication avant et après 1 'hybridation realisée à 50 °C pendant 16 heures, et la détection des cellules fluorescentes par FCM. De plus, 1 'utilisation de la cytométrie de flux a permis d'effectuer des analyses rapides et automatisées. Par contre, bien que la technique ait réussi à détecter les deux souches en culture pure, elle a aussi confirmé une importante corrélation de la réussite de la technique avec la dispersion des cellules et la phase de croissance de culture.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Ahmad, Darakhshan
Mots-clés libres:	microflore ; intestinale ; lactobacille ; bacterie ; gram ; bifidobacterie ; digestion
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	15 mai 2014 18:45
Dernière modification:	18 déc. 2015 19:47
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/2139

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