Cartographie antigénique et immunogénicité de la nucléoprotéine du Circovirus Porcin de type 2.

Racine, Sébastien (2004). Cartographie antigénique et immunogénicité de la nucléoprotéine du Circovirus Porcin de type 2. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 125 p.

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Résumé

Le circovirus porcin de type 2 (CVP2) est un petit virus à ADN circulaire simple brin infectant les jeunes porcs. Découvert en 1997, il serait impliqué dans le développement du syndrome de dépérissement multisystémique en post-sevrage (SDMPS) chez le porc, affliction qui entraîne des retards de croissance, 1'émaciation, le dépérissement et des problèmes respiratoires chez les porcelets nouvellement sevrés. Le syndrome engendre des pertes économiques importantes pour les producteurs de porcs dans de nombreuses parties du globe. Cependant personne n'est encore parvenu à contrôler la progression du syndrome, et son mode précis de transmission ainsi que les facteurs précis qui provoquent l'apparition des symptômes sont encore inconnus. L'objectif de ce projet était de cloner l'ORF2 du CVP2 dans un vecteur d'expression eucaryote afin de produire une protéine de nucléocapside virale recombinante permettant d'identifier les épitopes principaux du virus et de mettre au point un test de diagnostic fiable et sensible pour la détection sérologique du virus. La séquence de l'ORF2 du virus a été amplifiée par PCR et clonée dans un vecteur d'expression eucaryote de type pCEP5 pour produire le plasmide pCEP5-6H-ORF2. Des cellules de type HEK 293 ont été transfectées avec le plasmide et l'expression de la protéine a été confirmée par immunofluorescence et par immunobuvardage. La protéine de la nucléocapside recombinante porte une séquence polyhistidine ce qui a permis de la purifier par chromatographie d'affinité sur colonne. Les cellules transfectées avec le plasmide et exprimant la nucléocapside recombinante ont été utilisées pour mettre au point un nouveau test diagnostique par immunofluorescence indirecte permettant la détection de très petites quantités d'anticorps dirigés contre le CVP2 dans le sérum des porcs. La sensibilité du test a été vérifiée par l'analyse de 44 sérums de champs de porcs provenant de fermes porcines touchées par le CVP2. Les résultats ont été comparés avec le test de diagnostic classique utilisant des cellules PKA infectées par le CVP2, ce qui a confirmé que le test avec les cellules transfectées permettant la détection d'un plus grand nombre d'animaux positifs. Afin de déterminer si la seule infection au CVP2 est suffisante pour induire l'apparition du SDMPS chez les porcs, de caractériser la réponse sérologique des porcs à cette infection et d'obtenir des stocks de sérum contenant des anticorps polyclonaux contre le virus, un groupe de quatre porcelets âgés de cinq semaines ont été infectés avec du CVP2 concentré et purifié. Deux porcelets ont été gardés comme témoins négatifs. Des anticorps contre le CVP2 sont apparus chez les porcs infectés environ une semaine post-infection, ainsi que chez les porcs témoins environ deux semaines après l'infection initiale. Chez les deux groupes de porcelets les concentrations d'anticorps dans le sérum ont été à leur maximum entre les 5e et 6e semaines, et ont par la suite légèrement diminuées pour atteindre un plateau jusqu'au sacrifice des animaux au 74e jour de l'expérience. Des symptômes très légers du SDMPS ont été observés chez les animaux mais se sont résorbés avant la fin de l'expérience. Les organes des animaux sacrifiés ne portaient aucune trace des lésions caractéristiques du SDMPS. Des anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre la nucléocapside virale ont été produits en immunisant des souris Balb/c avec du CVP2 concentré et purifié. La souris ayant réagit le plus fortement après six injections a été sacrifiée et ses splénocytes ont été fusionnés avec des cellules Sp2/0 et mis en culture. Les hybridomes ont été criblés par ELISA, immunobuvardage et par immunofluorescence . Six anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre la nucléocapside ont été obtenus. La séquence d'acides aminés de l'ORF2 a été analysée par ordinateur afin d'identifier trois régions de la protéine susceptibles de porter des épitopes majeurs. Les régions N-tenninale, interne et C-tenninale ont été amplifiées par PCR et clonées dans le vecteur pCEP5. Des cellules HEK 293 ont par la suite été transfectées avec chacun des trois plasmides et l'expression de chacun des fragments de la protéine a été observée par immunofluorescence. Seul le fragment C-tenninal de la nucléocapside a réagit avec des anticorps olyclonaux spécifiques au CVP2.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Dea, Serge
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Tijssen, Peter
Mots-clés libres:	immunogenicite ; nucleoproteine ; circovirus ; porcin
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	12 déc. 2013 19:47
Dernière modification:	16 déc. 2015 21:26
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/1859

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