Synthesis, characterization and anticancer/antifungal evaluation of ruthenium complexes bearing an enzyme inhibitor

Golbaghi, Golara (2020). Synthesis, characterization and anticancer/antifungal evaluation of ruthenium complexes bearing an enzyme inhibitor Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 112 p.

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Résumé

Plusieurs personnes à travers le monde et approximativement 50% des Canadiens seront atteints du cancer au cours de leur vie, et il est attendu qu'un quart de tous les Canadiens succombera à cette maladie. Plus spécifiquement, une Canadienne sur quatre recevra un diagnostic de cancer du sein durant sa vie. Malgré les nombreux problèmes y étant associés, la chimiothérapie est de loin l'une des méthodes les plus efficaces pour le traitement de différents cancers. À comparer aux composés purement organiques, les complexes inorganiques possèdent des propriétés uniques, et peuvent offrir d'intéressantes opportunités au champ de la chimiothérapie. Un exemple de drogue très connue et utilisée en chimiothérapie est le cisplatine, un complexe à base d'un métal de transition qui est administré aux patients cancéreux pour le traitement d'une variété de cancers incluant celui du sein. Comme la cible des drogues à base de platine est principalement l'ADN, ces composés ne sont pas seulement toxiques pour les cellules cancéreuses, mais le sont aussi pour les cellules saines. Étant donné ce manque de sélectivité, les patients souffrent de plusieurs effets secondaires importants tels que la toxicité neurologique et/ou rénale ou bien la suppression de la moelle osseuse. En parallèle, les cellules cancéreuses développent une certaine résistance aux drogues à base de platine, limitant ainsi leur usage clinique. Malgré les importants problèmes lui étant associés, le cisplatine et ses dérivés sont toujours largement utilisés aujourd'hui. Le développement de nouveaux traitements alternatifs est donc requis, incluant le design de drogues inorganiques ayant une activité et sélectivité accrues.

Les complexes à base de ruthénium attirent présentement beaucoup l'attention, comme ils sont très prometteurs en vue de remplacer les drogues à base de platine en tant que traitement de première ligne: par exemple, certains 1) démontrent une activité considérable contre les lignées cellulaires résistantes au cisplatine, ii) induisent une incidence d'effets secondaires moins élevée à comparer aux agents thérapeutiques à base de platine, et iii) donnent lieu à activité antiproliférative selon différents mécanismes. Certains complexes à base de ruthénium comme RAPTA-C, NAMl-A, TLD-1433 et KP1090 ont été l'objet d'études précliniques et cliniques. Une stratégie intéressante pouvant potentiellement augmenter la probabilité de survie de patients atteints du cancer est de créer des drogues multitâches, capable de promouvoir la mort de cellules cancéreuses par divers mécanismes, simultanément. Les complexes de ruthénium comportant des ligands ayant une activité biologique connue émergent comme étant des candidats prometteurs pour différentes raisons: 1) cette stratégie peut mener à des complexes de ruthénium multitâches pour lesquels le métal et les ligands sont mutuellement responsables pour leur activité anticancéreuse, permettant ainsi de réduire l'incidence de mécanismes de résistance, et il) les effets synergiques potentiels résultant de l'usage combiné de plusieurs drogues peut mener à des traitements à plus court terme.

Le projet de recherche présenté ici a pour but la création de nouvelles drogues à base de ruthénium comportant des inhibiteurs de croissance cellulaire (anastrozole et letrozole) qui sont largement utilisés pour le traitement des cancers à récepteurs d'oestrogène positifs (ER+). L'aromatase (CYP19) est une enzyme responsable de catalyser la réaction de production d'oestrogène chez les femmes ménopausées. Il a été rapporté que l'anastrozole et le letrozole se lient au fer de l'enzyme aromatase via la coordination d'un azote de leur cycle triazole, résultant en l'inhibition de l'activité catalytique de l'enzyme et la déprivation des cellules cancéreuses ER+ de leur oestrogène. Les principaux objectifs de cette thèse de doctorat sont les suivants: 1) synthétiser, purifier et caractériser différents complexes de ruthénium comportant des ligands pouvant inhiber la croissance des cellules cancéreuses (anastrozole et letrozole); il) évaluer in vitro l'activité antiproliférative ainsi que les propriétés inhibitrices de l'aromatase de ces complexes de ruthénium dans des lignées cellulaires de cancer du sein, et évaluer leur toxicité in vivo; iil) apporter des modifications structurales aux complexes de ruthénium, et évaluer leur influence sur leur activité, sélectivité et toxicité .

Au cours de ce projet, plusieurs complexes de Ru(ll) et Ru(lll) ayant des structures différentes et comparant des inhibiteurs de l'aromatase ont été synthétisés en utilisant des techniques d'atmosphère inerte telles que des systèmes de lignes à Schlenk, de boîte-à-gants et de purification de solvants. Les espèces ont ensuite été caractérisées en utilisant diverses techniques telles que la spectroscopie RMN, l'analyse élémentaire, la spectrométrie de masse et l'analyse structurale par diffraction des rayons-X. La solubilité et la stabilité des composés ont été testées préalablement à l'étude de leur activité en milieu biologique. Une série de complexes Ru(ll)-benzene comportant un ligand anastrozole ont été synthétisés et leur potentiel anticancéreux évalué contre des cellules de cancer du sein ER+. Bien que les complexes ont démontré une considérable cytotoxicité in vitro contre les cellules de cancer du sein, seulement un de ces composés s'est avéré assez stable en milieu de culture cellulaire et a démontré s'accumuler de façon accrue dans les cellules cancéreuses. Alors que l'anastrozole seul n'a pas démontré de cytotoxicité in vitro contre les cellules cancéreuses, ce complexe de ruthénium a quant à lui démontré une considérable cytotoxicité ainsi qu'une certaine activité inhibitrice de l'enzyme aromatase, ce qui fut démontré de façons expérimentale et théorique. De plus, contrairement au cisplatine, les embryons de poisson zèbre ayant été exposés à certains de ces complexes de ruthénium (à 12.5 μM) ont suivi un développement normal, indiquant une faible toxicité pour ce type de composés. Les résultats de cette étude ont été publiés dans Organometallics 2019, 38, 702-711.

Suite à cette étude initiale, nous avons été intéressés à évaluer à quel niveau la nature du type de structure des complexes de ruthénium peut affecter leurs propriétés chimiques et biologiques. En fait, contrairement aux complexes Ru(ll)-benzène qui ont presque exclusivement été étudiés pour leurs applications contre le cancer, d'autres types de complexes de Ru(ll) n'ont pas été étudiées en profondeur à cette fin . De plus, les complexes de Ru(lll) ont été rapportés pour leurs propriétés antimétastatiques potentielles, faisant d'eux des candidats prometteurs pour l'inhibition de métastases chez les patients ayant reçu un diagnostic de cancer de sein métastatique. Lors de cette deuxième partie de l'étude, des espèces de ruthenium (Il) (Ru(ll)- cyclopentadiényle and Ru(ll)-cyclooctadiène) et de Ru(lll) comportant un inhibiteur de l'aromatase ont alors été synthétisées puis caractérisées. Dans le cas de la préparation du complexe Ru(ll)cyclooctadiène, une réaction assistée par un réacteur à micro-ondes fut développée puis optimisée afin d'améliorer le rendement et minimiser la durée de l'expérience. Plusieurs méthodes chromatographiques en phase normale ont aussi été développées afin de purifier certains des composés rapportés dans cette étude. Tandis que la plupart des complexes préparés pour cette étude se sont avérés instables en conditions biologiques, le complexe Ru(ll)cyclopentadiényle, la seule espèce de la série pour laquelle le ligand anastrozole est coordonné au ruthénium par une fonction nitrile (et non via l'azote de son cycle triazole), s'est avéré très stable en conditions biologiques, indiquant l'important effet du type de complexe de ruthénium et du mode de coordination de leurs ligands sur leur stabilité. Même si la cytotoxicité in vitro et la toxicité in vivo (modèle de poisson zèbre) de ce type de complexe a confirmé leur haut potentiel pour la thérapie du cancer du sein chez les cancers ER+ et les cancers agressifs triple négatif du sein (TNBC), nos études expérimentales et théoriques suggèrent que leur activité inhibitrice pour l'aromatase n'est pas plausible pour ce système étant donné l'encombrement stérique des groupes PPh3, prévenant ainsi l'interaction entre le complexe et l'enzyme cible. Les résultats de cette étude ont été publiés dans European Journal of Medicinal Chemistry 2020, 112030.

Le potentiel élevé de composés à base de métaux de transition pour des applications antifongiques et le fait que le mode d'action de certaines des drogues antifongiques (comme le fluconazole) soient connues pour impliquer une interaction entre un cycle azole et une enzyme fongique (CYP51), un mode d'action réminiscent de l'enzyme aromatase (CYP19) et certains de ses inhibiteurs, nous a motivé à évaluer l'activité antigongique du complexe de ruthénium préalablement investigué (qui comprend un cycle triazole libre dans sa structure) ainsi que quelques espèces structuralement rapprochées. CYP51 est connu pour catalyser la biosynthèse de l'ergostérole, la composante majeure de la membrane cellulaire fongique, jouant un rôle essentiel de biorégulation de la fluidité et l'intégrité de la membrane fongique. Nous avons mis l'emphase sur les infections de type candidose étant donné qu'elles sont une des majeures causes de morbidité et de mortalité, et ont une incidence croissante. Étant donné les profils variables de résistance antifongique rapportés pour différentes espèces de Candida, il est de grande importance d'étudier de nouvelles alternatives aux drogues présentement utilisées. Parmi les trois complexes de ruthénium cyclopentadiényles investigués, seulement les deux espèce cationiques (indépendamment de la présence d'un cycle triazole libre dans leur structure) ont démontré une activité inhibitrice significative contre certaines espèces de Candida, de façon importante contre les espèces ne répondant pas au traitement au fluconazole, indiquant l'importance de la nature du type de complexe de ruthénium sur leurs propriétés antifongiques. Il a été démontré que l'activité antifongique de ces complexes est reliée à leur niveau d'internalisation cellulaire de même qu'à leur abileté à générer des espèces réactives de l'oxygène (ROS). De plus, il a été démontré théoriquement (simulation docking) qu'une interaction entre le complexe comportant l'anastrozole et l'enzyme fongique CYP51 est énergiquement favorisée (à un niveau même plus important que celle avec fluconazole), suggérant un mode d'action plausible additionnel pour ce composé. Les résultats de cette étude ont été acceptés pour publication dans ChemBioChem - special issue metals in medicine 2020.

Les résultats découlant de ce projet de recherche procurent de l'information importante quant au développement de nouveaux complexes de ruthénium pour le traitement du cancer du sein et pavent une nouvelle avenue pour le design de complexes antifongiques à base de ruthénium pour le traitement de la candidose.

Many people ail over the world and roughly 50% of Canadians wiil struggle with cancer in their lifetime, and a quarter of ail Canadians are expected to die of this disease. More specificaily, one out of four Canadian women will be diagnosed with breast cancer during their lifetime. Despite its numerous drawbacks, chemotherapy is so far one of the most effective methods to treat different cancers. Compared to purely organic compounds, inorganic complexes have unique properties, and can offer great opportunities to the field of chemotherapy. A well-known example of chemotherapy drugs is cisplatin, a transition metal-based complex that has been administered to cancer patients for the treatment of various cancers including breast cancer. As the target of platinum drugs is DNA, they are not only taxie to cancer ce lis, but to healthy cells as well. Due to their lack of selectivity, patients suffer from many side effects such as neuro- and/or renal-toxicity or bone marrow-suppression. Besides, cancer ceils develop a resistance to platinum drugs, which limits their clinical use. Despite their important drawbacks, cisplatin and its derivatives are still widely used today. More development is then needed for the design of alternative inorganic drugs that are highly active and selective.

Ruthenium-based complexes currently attract great attention as they hold promise to replace platinum-based drugs as first line cancer treatment: for instance, they were found i) to exhibit considerable activity against cisplatin resistant ceil lines, il} to induce a lower occurrence of side effects in comparison to platinum-based therapeutics, and iil) to display their antiproliferative activity via different mechanisms. Sorne ruthenium-based compounds such as RAPTA-C, NAMlA, TLD-1433 and KP1090 have successfuily entered preclinical and clinical trials.

An appealing strategy to increase the survival probability of cancer patients is to create ruthenium multitasking drugs, able to promote cancer ceil death by various mechanisms, simultaneously. Ruthenium complexes bearing ligands with known biological activity emerge as highly promising candidates due to different reasons: l) this strategy may lead to multi-targeting ruthenium complexes in which both the metal center and ligand are mutuaily responsible for the anticancer activity of the drug which might contribute to circumvent resistance mechanisms, and il) potential synergistic effects resulting from the combined use of two drugs may lead to shorter-term treatments.

The research project presented here aims at creating navel ruthenium drugs bearing cancer cell growth inhibitors (anastrozole or letrozole) that are widely used aromatase inhibitors for the treatment of estrogen receptor positive (ER+) breast cancers. Aromatase (CYP19) is an enzyme responsible to catalyze the estrogen production reaction in postmenopausal women. lt has been reported that anastrozole and letrozole bind to the heme iron of the aromatase enzyme through the coordination of one nitrogen of their triazole ring, resulting in the inhibition of the catalytic activity of the enzyme and the deprivation of ER+ breast cancer cells from estrogen. Herein, the main objectives of this PhD thesis were the following: i) to synthesize, purify and characterize various ruthenium complexes bearing cancer cell growth inhibitor ligand(s) (anastrozole or letrozole); ii) to investigate the in vitro antiproliferative activity and aromatase inhibition property of these ruthenium complexes against breast cancer cell lines, and assess their in vivo toxicity; iii) to bring structural modifications to ruthenium complexes, and to evaluate their influence on their activity, selectivity and toxicity.

ln the course of this project, several structurally different Ru(ll) and Ru(lll) complexes bearing an aromatase inhibitor have been synthesized performing inert atmosphere techniques by using Schlenk line, glovebox and solvent purification systems. The species were characterized using various techniques such as NMR spectroscopy, elemental analysis, mass spectrometry and single crystal X-ray analysis. The stability and solubility of the compounds were tested prior to biological experiments. Accordingly, a series of Ru(ll)-benzene complexes bearing anastrozole have been synthesized and their anticancer potential investigated against ER+ breast cancers. Whereas ail these complexes showed considerable in vitro cytotoxicity in breast cancer ce lis, only one of them was found to be highly stable in cell culture media and to induce the most considerable cellular uptake in human breast cancer cells. Whereas anastrozole alone did not induce any in vitro cytotoxicity in the cancer cells, this ruthenium complex showed a considerable cytotoxicity and an aromatase enzyme inhibitory activity, which was studied experimentally and theoretically. Moreover, in contrast to cisplatin, zebrafish embryos exposed to the ruthenium complexes (at 12.5 μM) underwent a normal development, an indication of the lack of toxicity of this type of compounds. Results from this study were published in Organometallics 2019, 38, 702- 711.

Following this initial study, we have been interested to evaluate to what extent the backbone of these ruthenium complexes can affect their chemical and biological properties. Ruthenium (Il) (Ru(ll)-cyclopentadienyl and Ru(ll)-cyclooctadiene) and Ru(lll) species bearing an aromatase inhibitor were then synthesized and characterized. ln the case of the Ru(ll)-cyclooctadiene complex bearing anastrozole, a microwave-assisted reaction was developed and optimized to improve the reaction yield and minimize the duration of the experiment. Several normal-phase column chromatography methods were also developed to purify some of the species investigated in this study. ln fact, in contrast to Ru(ll)-benzene complexes which have been exclusively studied for anticancer applications, other types of Ru(ll) species have been overlooked for this purpose. Moreover, Ru(lll) complexes have been reported for their potential antimetastatic properties, making them promising candidates for the inhibition of metastasis in patients diagnosed with metastatic breast cancers. Whereas most of the complexes prepared for this study were found unstable under biological relevant conditions, a Ru(ll)-cyclopentadienyl complex, the only species in this series for which anastrozole is coordinated ruthenium through the nitrile moiety (and not via the nitrogen of the triazole ring), was found to be highly stable under biologically relevant conditions, indicating the important effect of the ruthenium backbone on the stability and coordination mode of the complexes. Even though in vitro cytotoxicity and in vivo toxicity investigations (zebrafish model) of this complex confirmed its high potential for breast cancer therapy in both ER+ and aggressive triple negative breast cancer (TNBC), our experimental and theoretical studies suggested that its aromatase inhibitory activity is not likely to take place in this system due to the bulkiness of the PPh3 moieties, preventing the interaction between the complex with the targeted enzyme. Results from this study were published in European Journal of Medicinal Chemistry 2020, 112030.

The high potential of metal-based compounds for antifungal applications and the fact that the mode of action of some currently used antifungal drugs (such as fluconazole) is known to involve an interaction between an azole ring and a fungal enzyme (CYP51 ), mode of action reminiscent of the aromatase enzyme (CYP19) and some of its inhibitors, prompted us to evaluate the antifungal activity of the ruthenium cyclopentadienyl complex we previously investigated (including a metal-uncoordinated triazole moiety in its structure) along with two closely related species. CYP51 is known to catalyze the biosynthesis of ergosterol, the major component of the fungal cell membrane, playing an essential role as a bioregulator of fungal membrane flu idity and integrity. We specifically focused on Candidiasis infections that are one of the most major causes of morbidity and mortality, and their increasing incidence ^[1][1][1]. Because of the variable antifungal resistance profiles reported for different Candida species, it is of high importance to study new possibilities that could be used as alternatives to the currently used antifungal drugs. Among the three ruthenium cyclopentadienyl complexes investigated, only the two cationic species (regardless of the presence of a free triazole in their structures) showed significant growth inhibitory activity in Candida species, more importantly in species that did not respond to a fluconazole treatment, indicating the importance of the nature of the ruthenium complex backbone on its antifungal properties. The antifungal activity of these complexes was found to be related to the amount of ruthenium cellular uptaken and the intracellular reactive oxygen species (ROS) generated. Furthermore, we could theoretically demonstrate (docking simulation) that an interaction between the complex bearing anastrozole and the fungal CYP51 enzyme is energetically favorable (to an even greater extent than with fluconazole), suggesting a plausible additional mode of action for this compound. Results from this study were accepted for publication in ChemBioChem - special issue metals in medicine 2020.

Our research findings provide important information on the development of nove! ruthenium complexes for the treatment of breast cancer and open a new door to the design of rutheniumbased drugs as anti-Candida species.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Castonguay, Annie
Mots-clés libres:	métallodrogue; complexe de ruthénium; cancer du sein; résistance aux médicaments; anticancéreux; antifongique; candidose; inhibiteur de l'aromatase; metal-based drug; ruthenium complex; breast cancer; drug resistance; anticancer; antifungal; Candida infection; aromatase inhibitor
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	06 nov. 2024 15:55
Dernière modification:	06 nov. 2024 15:55
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15914

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