Synthesis of potential inhibitors and siderophore conjugates of Kdo-processing enzymes

Ravicoularamin, Gokulakrishnan (2019). Synthesis of potential inhibitors and siderophore conjugates of Kdo-processing enzymes Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en sciences expérimentale de la santé, 179 p.

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Résumé

There is an important need for new types of antibacterial agents in present days because of the increased resistance of pathogenic bacteria. Inhibiting enzymes involved in the biosynthesis of polysaccharides from Gram-negative bacteria (GNB), such as lipopolysaccharides (LPS) and exopolysaccharides (EPS), stands as an underexploited approach to pursue. Such inhibition could ultimately lead to damaging of the outer membrane of GNB, which would pave the way for the development of broad spectrum-antibiotics, as LPS is a major structural backbone of outer membrane as well as a virulence factor. Cytidine monophosphate 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid (CMP-Kdo) synthase (CKS) is a crucial enzyme for LPS biosynthesis as it catalyses the rate-determining step for the formation of lipid A-Kdo2, which is responsible of membrane integrity. In order to tackle the obstacle of bacterial membrane diffusion, the “Trojan horse” strategy of covalently linking iron(III)-chelating siderophore to the LPS inhibitor has been pursued. Since iron is crucial for the metabolism of GNB, we have hypothesized that the “Trojan horse” strategy will enhance the delivery of inhibitors of Kdo-processing enzymes across the bacterial membranes. Kdo residues are also found in the EPS of Burkholderia spp., which is an important component of bacterial biofilm and is involved in the pathogenesis of Burkholderia-related infections.

Therefore, the objectives of the research project are: 1) to synthesize Kdo mimics that could act as potential inhibitors of Kdo-processing enzymes involved in the biosynthesis of Kdo-containing LPS and EPS from pathogenic GNB; and 2) to couple the former set of inhibitors with siderophores bearing either releasable or non-releasable linkers, leading to siderophore conjugates. The releasable linker will ensure the enzymatic cleavage of conjugates releasing the inhibitor in its free form within the cytoplasm for improved binding affinity with the cytoplasmic target. 2-Deoxy and 8-amino-2,8-deoxy Kdo derivatives were synthesized via two different routes starting from D-mannose and D-arabinose. While the former was synthesized in both α- and β-forms, the latter was designed to deliver exclusively the β-form. Compounds were also prepared under their acetylated forms in order to improve their penetration to the cytoplasm owing to bacterial esterases. The commercially available xenosiderophore desferrioxamine B will subsequently be covalently linked to Kdo derivatives through a synthetic releasable linker, consisting of disulphide bond that could be cleaved under the reducing conditions of cytoplasm. Kdo glycosides in both α- and β-anomeric forms were synthesized through multi-step synthesis starting from D-arabinose. As a preliminary assay, Kdo derivatives were evaluated for their ability to inhibit the formation of EPS from Burkholderia spp. in collaboration with the group of Prof. Éric Déziel from INRS-Institut Armand-Frappier. We showed that 2-adamantane glycosides of Kdo are able to prevent the formation of mucoid bacteria and that only the β-forms are active. In order to quantify the inhibition, 8-d-azido-Kdo were prepared and will be used to label the EPS of bacteria through strain-promoted alkyne-azide cycloaddition with a dibenzylcyclooctyne derivative covalently linked to a fluorescent dye. Another Kdo analogue, 7-d-azido-Kdo was also synthesized through a synthetic pathway starting from L-xylose for similar purpose.

The siderophore conjugates will be tested for their in vitro antibacterial activity against several GNB, including Burkholderia cepacia complex species and Pseudomonas aeruginosa.

Ultimately, the research project could generate novel sugar-based chemical entities, which could be used as antibiotic agents or antibiotic adjuvants against pathogenic GNB.

Un besoin important de nouveaux types d'agents antibactériens peut être identifié de nos jours en raison de la résistance accrue des bactéries pathogènes. L'inhibition des enzymes impliquées dans la biosynthèse des polysaccharides des bactéries à Gram négatif (BGN), comme les lipopolysaccharides (LPS) et les exopolysaccharides (EPS), constitue une approche sous-exploitée à approfondir. Une telle inhibition pourrait finalement endommager la membrane externe du GNB, ce qui ouvrirait la voie au développement d'antibiotiques à large spectre car le LPS est un squelette structurel majeur de la membrane externe ainsi qu'un facteur de virulence. Cytidine monophospate 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique (CMP-Kdo) synthase (CKS) est une enzyme cruciale pour la biosynthèse du LPS, du fait qu’elle catalyse l'étape de détermination du taux de formation du lipide A-Kdo2, qui est responsable de l'intégrité de la membrane. Afin de surmonter l'obstacle de la diffusion de la membrane bactérienne, la stratégie du « cheval de Troie », consistant à lier de manière covalente un sidérophore chélatant de fer (III) à l'inhibiteur de LPS, a été poursuivie. Étant donné que le fer est crucial pour le métabolisme du BGN, nous avons émis l'hypothèse que la stratégie du « cheval de Troie » améliorera la distribution d'inhibiteurs des enzymes de traitement du Kdo à travers les membranes bactériennes. Des résidus de Kdo sont également trouvés dans l'EPS de Burkholderia spp., Il s’agit d’un composant important du biofilm bactérien, impliqué dans la pathogenèse des infections liées à Burkholderia.

Par conséquent, les objectifs du projet de recherche sont les suivants : 1) synthétiser des analogues de Kdo qui pourraient agir comme inhibiteurs potentiels des enzymes de traitement de Kdo impliquées dans la biosynthèse de LPS et EPS contenant du Kdo dans les BGN pathogènes; et 2) coupler ces inhibiteurs avec des sidérophores portant des lieurs libérables ou non libérables, conduisant à des conjugués sidérophores. Le lieur libérable assurera le clivage enzymatique des conjugués libérant l'inhibiteur sous sa forme libre dans le cytoplasme pour améliorer son affinité avec la cible cytoplasmique. Les dérivés 2-désoxy et 8-amino-2,8-désoxy Kdo ont été synthétisés par deux voies différentes à partir du D-mannose et du D-arabinose. Alors que le premier a été synthétisé sous les formes α- et β-, le deuxième a été conçu pour obtenir exclusivement la forme β. Des composés ont également été préparés sous leurs formes acétylées afin d'améliorer leur pénétration dans le cytoplasme grâce aux estérases bactériennes. Le xénosidérophore desferrioxamine B disponible dans le commerce sera ensuite lié de manière covalente aux dérivés de Kdo par le biais d'un lieur synthétique libérable, constitué d'une liaison disulfure qui pourrait être clivée dans les conditions réductrices du cytoplasme.

Les Kdo glycosides sous les formes anomères α- et β- ont été synthétisés par synthèse en plusieurs étapes à partir du D-arabinose. À titre d'essai préliminaire, les dérivés de Kdo ont été évalués pour leur capacité à inhiber la formation d'EPS dans Burkholderia spp. En collaboration avec le laboratoire du Prof. Éric Déziel de l'INRS-Institut Armand-Frappier, nous avons montré que les glycosides 2-adamantane de Kdo sont capables d'empêcher la formation de bactéries mucoïdes et que seules les formes β sont actives. Afin de quantifier l'inhibition, le 8-d-azido-Kdo a été préparé et sera utilisé pour marquer l'EPS des bactéries par cycloaddition d'alcyne-azoture favorisée par une souche avec un dérivé de dibenzylcyclooctyne lié de manière covalente à un colorant fluorescent. Un autre analogue de Kdo, le 7-d-azido-Kdo a également été synthétisé par une voie de synthèse à partir du L-xylose dans un but similaire.

Les conjugués de sidérophore seront testés pour leur activité antibactérienne in vitro contre plusieurs BGN, y compris les espèces du complexe Burkholderia cepacia et Pseudomonas aeruginosa. En fin de compte, le projet de recherche pourrait générer de nouvelles entités chimiques à base de sucre, qui pourraient être utilisées comme agents antibiotiques ou adjuvants antibiotiques contre les BGN pathogènes.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Gauthier, Charles
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	09 juill. 2024 15:17
Dernière modification:	09 juill. 2024 15:17
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15835

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