Metabolic labelling of the Myxococcus xanthus outer membrane

Ramirez Esquivel, Eric (2021). Metabolic labelling of the Myxococcus xanthus outer membrane Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 57 p.

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Résumé

Le remodelage de la surface des cellules bactériennes est un phénomène omniprésent pour maintenir les connexions avec le substrat et / ou d’autres cellules, facilitant ainsi la communication, la coordination comportementale et la résidence à long terme. Chez les bactéries à Gram négatif, la surface cellulaire est composée en grande partie de lipopolysaccharide (LPS) dans le feuillet externe de la membrane externe (ME). Avec la bactérie modèle Gram négatif Myxococcus xanthus (membre des δ-proteobactéries), les agrégats cellulaires sont connectés les uns aux autres via des réseaux de tubes dérivés de la ME (TME) et des chaînes de vésicules (VME) composées de LPS. Les VME sont omniprésentes chez les bactéries à Gram négatif et sont impliquées dans la communication, le transfert d'ADN, la digestion des nutriments et la dissémination des toxines ; cependant, le mécanisme d'extrusion de la ME est mal compris généralement. Pour étudier ce phénomène en temps réel, on a besoin d’une méthode pour marquer le LPS sans tuer les bactéries. Mes études m’ont permis de développer un marquage de la ME de M. xanthus, par fluroescence via l’incorporation métabolique de Kdo-N3 synthétisé, suivi de l'attachement covalent au groupe -N3 avec DBCO-sulforhodamine via une réaction de chimie "clic". Cela a permis le premier marquage spécifique du LPS dans la ME de M. xanthus. Des tests de physiologie de M. xanthus en ce qui concerne la motilité unicellulaire et de groupe, ainsi que la formation des corps fructifères ont été réalisés. Aucune différence à l'échelle de la communauté n'a été observée au cours des différentes étapes du cycle de vie de M. xanthus suite aux marquage par clic (Kdo-N3 et DBCO-sulforhodamine). De plus, une vérification de marquage via une réaction clic de la ME a été réalisée par une extraction de LPS, par la méthode de Hitchcock et Brown ; cet échantillon de LPS marqué a été séparé par électrophorèse sur un gel SDS, suivi d’une analyse utilisant un scanner Typhoon, révélant un modèle d'échelle fluorescente en gel compatible avec l'incorporation réussie du Kdo-N3 et le marquage chimique par clic du sucre synthétique dans la ME de M. xanthus.

Remodelling of the bacterial cell surface is a ubiquitous phenomenon for maintaining connections with the substratum and/or other cells, thus facilitating communication, behavioral coordination, and long-term residence. In Gram-negative bacteria, the cell surface is composed largely of lipopolysaccharide (LPS) in the outer leaflet of the outer membrane (OM). With the model Gram-negative δ-proteobacterium Myxococcus xanthus, cell aggregates become connected to each other over distances via networks of OM tube (OMTs) and vesicle (OMV) chain structures composed of LPS. OMVs are ubiquitous in Gram-negative bacteria and implicated in communication, DNA transfer, nutrient digestion, and toxin delivery; however, the mechanism of OM extrusion is poorly understood. To study this phenomenon in real time, a method to label the LPS is required, one which does not impact cell viability. During my studies, I successfully fluorescently labelled the M. xanthus OM via the metabolic incorporation of in-house-synthesized Kdo-N3, followed by "click" chemistry-based covalent attachment of DBCO-sulforhodamine to the -N3 moiety. This allowed for the first-ever LPS-specific labelling of the M. xanthus OM. Testing of M. xanthus physiology with respect to single-cell and group motility, as well as fruiting body formation were carried out. No differences regarding community-wide effects were observed during the various stages of the M. xanthus life cycle with the corresponding permutations of click-labelling components (Kdo-N3 and DBCO-sulforhodamine). Moreover, OM labelling was successfully verified via extraction of LPS, labelled via a "click" reaction, by the Hitchcock & Brown method; this LPS was resolved on a gel via SDS-PAGE gel, followed by analysis with a Typhoon scanner, revealing an in-gel fluorescence ladder pattern consistent with successful Kdo-N3 incorporation and click chemistry labelling of the synthetic sugar in the M. xanthus OM.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Islam, Salim Timo
Mots-clés libres:	membrane externe; chimie « clic »; Kdo; lipopolysaccharide (LPS); outer membrane; click chemistry
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	09 juill. 2024 15:20
Dernière modification:	09 juill. 2024 15:20
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15830

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