Identification of Dictyopanus pusillus as a promising candidate for enzymatic lignocellulose pretreatment of oil palm tree residues

Rueda, Andres (2019). Identification of Dictyopanus pusillus as a promising candidate for enzymatic lignocellulose pretreatment of oil palm tree residues Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 186 p.

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Résumé

Basidiomycete fungi are the most important organisms involved in wood recycling in nature trough production of ligninolytic enzymes able to degrade lignocellulose to obtain energy. Bioprospection of basidiomycete fungi and their ligninolytic enzymes is a valuable asset for the development of biotechnological delignification processes. Now, lignocellulolytic residue accumulation has been increasing over the years due to worldwide population growth and lignocellulose is one of the most promising renewable sources for bioethanol production. It encourages the use of by-products derived from the agro-industry as a practical alternative strategy for handling the accumulation of waste products with high energetic value. Bioethanol production using lignocellulose necessitates a selective pretreatment removing lignin to release cellulose and hemicellulose, which are then hydrolyzed to obtain sugars that can then be fermented to produce ethanol. Until now, the pretreatment process is the only step that has been supported by an effective biotechnological strategy, and still depends on chemicals or high energy demand strategies. Enzymatic pretreatment of lignocellulose would be a green alternative for the delignification process that occurs within cellulosic ethanol industry.

Among basidiomycete oxido-reductase enzymes, peroxidases, such as lignin peroxidases, manganese peroxidases and versatile peroxidases, and catalases as laccases are ligninolytic enzymes that oxidize lignin present in wood that could offer an environmental-friendly alternative for the exploitation of lignocellulosic by-products. Various agroindustries generate such by-products but oil palm (Elaeis guineensis) is the principal source of oil in the world, with Malaysia and Indonesia being the main producers followed by Nigeria, Thailand and Colombia. This specific culture generates important quantities of residues and for instance for Colombia, it means that in 2014 from 1.1 million tons of palm oil obtained, 3.3 million tons of wastes were generated.

Thus, the objective of this research project was to perform bioprospection of white-rot native Colombian basidiomycete fungi with ligninolytic activity and explore their genome to identify enzymes capable of handling the pretreatment of palm oil tree lignocellulosic residues. Selection of basidiomycete fungi with ligninolytic activity was achieved using Solid State Fermentation and delignification capacity of enzymatic extracts was evaluated over lignocellulose from oil palm.

It arose from this study that the isolation of a Colombian native Dictyopanus pusillus-LMB4 basidiomycete fungus showed a relevant laccase activity (267.6 U.L-1 after 28 days of fermentation). Interestingly, this specie had not yet been reported as an efficient ligninolytic organism. Enzymatic crude extract with laccase activity from native D. pusillus-LMB4 was used for a pretreatment process of empty fruit bunches lignocellulose to obtain reducing sugars. Ligninolytic protein characterization, mainly laccases, of this enzymatic crude extract showed the presence of at least one enzyme with laccase activity by zymogram analysis and mass spectrometry peptide identification. Genomic exploration of D. pusillus-LMB4 revealed the existence of 14 genes that have similarity with other reported laccase enzymes. To our knowledge this work presents the first genomic exploration of a Dictyopanus species with an emphasis on laccase enzymes that could be used for lignocellulose pretreatment during cellulosic ethanol production and bioremediation of soils and wastewaters, among others. Hence, these results report Dictyopanus pusillus-LMB4 as a new ligninolytic species, and its laccase enzymes as possible future green alternatives for the pretreatment of lignocellulose biomass from the agroindustry

Los hongos basidiomicetos son los organismos más importantes en el reciclaje de la madera en la naturaleza a través de la producción de enzimas ligninolíticas capaces de degradar lignocelulosa para la obtención de energía. La bioprospección de hongos basidiomicetos y sus respectivas enzimas ligninolíticas son de gran valor para el desarrollo del proceso biotecnológico de deslignifcación. Actualmente la acumulación de residuos ligninolíticos ha incrementado en los últimos años, como consecuencia del crecimiento de la población mundial, siendo la lignocelulosa una de las más prometedoras fuentes renovables para la producción de bioetanol. Lo anterior incentiva el uso de subproductos provenientes de la agroindustria como una alternativa estratégica para el manejo y la acumulación de productos de desecho de alto valor energético. Para la producción de bioetanol es necesario un pretratamiento para la remoción de la lignina y así permitir la liberación de la celulosa y hemicelulosa, que permite la hidrolisis de estos carbohidratos para la obtención de azúcares que finalmente son fermentados para la producción de etanol. Hasta el momento, el pretratamiento es la única etapa que no ha sido soportada por una estrategia biotecnológica efectiva, dependiendo de compuestos químicos o procesos que demandan alta energía. El pretratamiento enzimático de la lignocelulosa podría ser una alternativa verde para el proceso de deslignificación en la industria del bioetanol celulósico.

Entre las enzimas de los hongos basidiomicetos se encuentran peroxidasas como manganeso peroxidasas, lignina peroxidasas y versátil peroxidasas, y catalasas como las lacasas, estas enzimas ligninolíticas son capaces de oxidar la lignina presente en la madera, ofreciendo una alternativa amigable con el medio ambiente para la explotación de subproductos lignocelulósicos. Existen varias agroindustrias que generan subproductos lignocelulósicos, un ejemplo es la industria de la palma aceitera (Elaeis guineensis), que es la principal fuente de aceite a nivel mundial, siendo Malasia e Indonesia los mayores productores de aceite, seguidos por Nigeria, Tailandia y Colombia. El cultivo de palma genera importantes cantidades de residuos, como sucede en Colombia, donde se produjeron 1.1 millones de toneladas de aceite de palma, generando 3.3 millones de toneladas de desechos lignocelulósicos para el año 2014.

Con base a lo anterior, el objetivo de este proyecto de investigación fue realizar la bioprospección de hongos basidiomicetos nativos colombianos con actividad ligninolítica y explorar su genoma para identificar enzimas con la capacidad de realizar el pretratamiento de residuos lignocelulósicos de la palma aceitera. Aislamiento y selección de hongos basidiomicetos con actividad ligninolítica fueron logrados por medio de fermentación en estado sólido, al igual que la capacidad ligninolítica de los extractos enzimáticos obtenidos sobre lignocelulosa de palma aceitera.

Como resultado de esta investigación se obtuvo el hongo basidiomiceto colombiano Dictyopanus pusillus-LMB4, el cual mostró una relevante actividad lacasa, interesantemente, esta especie no ha sido aún reportada como un eficiente organismo ligninolítico. El extracto enzimático crudo con actividad lacasa del asilamiento nativo D. pusillus-LMB4 fue usado para el pretratamiento de lignocelulosa de racimos vacíos de palma aceitera para la obtención de azúcares reductores; la caracterización de las proteínas de este extracto enzimático crudo mostró la presencia de al menos una enzima con actividad lacasa; la exploración genómica de D. pusillus-LMB4 mostró la existencia de 14 genes que poseen similitud con otras enzimas lacasas reportadas. A nuestro conocimiento esté trabajo muestra la primera exploración genética de una especie de Dictyopanus con énfasis en enzimas lacasas. Enzimas que podrían para el pretratamiento de lignocelulosa en la producción de etanol celulósico. Por consiguiente, estos resultados reportan a la especie Dictyopanus pusillus como un nuevo organismo lignolítico y sus enzimas lacasas como una posible alternativa verde para el pretratamiento de biomasa lignocelulósica de la agroindustria.

Les champignons basidiomycètes forment le principal groupe d’organismes vivants responsables du recyclage du bois grâce à une production d’enzymes ligninolytiques qui leur permettent d’en retirer une source d’énergie. La bioprospection de ces champignons et de leurs enzymes ligninolytiques est donc un atout pour le développement de procédés biotechnologiques de délignification. De plus, l’accumulation de résidus en lignine s’est accentuée au cours des dernières années due à la croissance mondiale de la population, mais la lignocellulose est une source renouvelable pour la production de bioéthanol. Cette pratique encourage l’utilisation des sous-produits dérivés de l’agro-industrie comme stratégie alternative pour prévenir l’accumulation de résidus à haute valeur énergétique. La production de bioéthanol nécessite un prétraitement visant à enlever la lignine pour libérer la cellulose et l’hémicellulose, qui sont ensuite hydrolysées en sucres fermentables pour la production d’éthanol. Or, le prétraitement pour enlever la lignine est la seule étape qui n’a pas encore été adaptée efficacement au sein d’un procédé biotechnologique et elle repose actuellement sur l’utilisation de méthodes chimiques ou de procédés énergivores. Un prétraitement enzymatique offrirait donc une alternative écologique pour le processus de délignification effectué par l’industrie de bioéthanol cellulosique.

Parmi les enzymes des champignons basidiomycètes, on trouve les péroxydases telles que les péroxydases de manganèse, les péroxydases de lignine et les péroxydases polyvalentes, et les catalases telles que les laccases, des enzymes ligninolytiques qui oxydent la lignine qui compose le bois et qui pourraient former une alternative écologique à l’exploitation de sous-produits de lignocellulose. Différentes agro-industries génèrent de tels sous-produits, mais le palmier à huile (Elaeis guineensis) est la principale source d’huile végétale dans le monde, la Malaisie et l’Indonésie étant les plus importants producteurs, suivis du Nigeria, de la Thaïlande et de la Colombie. Cette culture génère de grandes quantités de résidus puisque, par exemple pour la Colombie en 2014, 3,3 millions de tonnes de résidus ont été générés pour 1,1 millions de tonnes d’huile de palme obtenus.

Donc, l’objectif de cette étude était d’effectuer la bioprospection de champignons basidiomycètes de la Colombie ayant une activité ligninolytique et une exploration de leur génome afin d’identifier des enzymes pouvant effectuer le prétraitement de résidus ligneux provenant du palmier à huile. La sélection des espèces de basidiomycète s’est effectuée par fermentation sur phase solide et leur pouvoir de délignification a été évalué en utilisant de la lignocellulose de palmier à huile.

L’étude a démontré qu’un isolat du basidiomycète Dictyopanus pusillus-LMB4 possédait une activité laccase intéressante. Or, cette espèce n’avait pas à ce jour été identifiée parmi les organismes lignivores. Un extrait brut enzymatique de D. pusillus-LMB4 ayant une activité laccase a été utilisé pour le prétraitement de fruits vides du palmier à huile et a engendré la production de sucres réducteurs. De plus, la caractérisation de cet extrait enzymatique a mis en évidence la présence d’au moins une enzyme ayant une activité laccase. L’exploration génomique de D. pusillus-LMB4 a démontrée l’existence de 14 gènes possédant des similarités avec différentes laccases précédemment identifiées. Cette étude constituerait la première documentation du génome de D. pusillus-LMB4 mettant l’emphase sur les laccases qui pourraient être utilisées pour le processus de prétraitement menant à la production d’éthanol cellulosique.

Bref, ces résultats inscrivent Dictyopanus pusillus parmi les organismes lignivores ainsi que ses laccases comme une alternative pour le développement de procédées écologiques pour la délignification de la biomasse lignocellulosique provenant de l’industrie agro-alimentaire.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Doucet, Nicolas
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Ospina, Sonia A. (Universidad Nacional de Colombia)
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	09 juill. 2024 15:28
Dernière modification:	09 juill. 2024 15:28
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15819

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