Implementing methods and processes to support fragment-based drug discovery initiatives

Ayotte, Yann (2023). Implementing methods and processes to support fragment-based drug discovery initiatives Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en innovation pharmaceutique, 300 p.

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Résumé

Au cours des dernières décennies, il y a eu un intérêt croissant pour les approches de découverte de pistes basées sur des fragments (FBLD, fragment-based lead discovery). En raison de leur faible poids moléculaire et de leur complexité, les fragments peuvent sonder une plus grande partie de l'espace chimique, ce qui nécessite donc des chimiothèques beaucoup plus petites, ce qui rend le FBLD beaucoup plus accessible aux petites institutions. Les approches par fragments sont également de plus en plus utilisées contre des cibles difficiles où les poches de liaison moins traitables ne peuvent pas toujours être sondées avec les méthodes classiques.

Cependant, la détection de fragments possédant de faibles affinités de liaison nécessite fréquemment des concentrations élevées de ligand, ce qui peut augmenter les risques d'artefacts dus à l'auto-agrégation. Nous avons donc validé l'utilisation d’une expérience T2-CPMG de résonance magnétique nucléaire (RMN) comme outil de détection d'agrégation. La méthode est versatile et se prête à un haut débit permettant la surveillance du comportement des composés en parallèle au criblage.

Un autre défi dans la découverte de médicaments est de hiérarchiser l’affinité des composés testés afin de guider l'optimisation chimique de ces composés. La RMN est fréquemment utilisée pour l'évaluation de la liaison, car elle est sensible aux événements de liaison de faibles affinités. Cependant, les méthodes RMN standard pour la détermination de constantes d’affinités nécessitent l'utilisation de plusieurs points de titrage, ce qui rend ces approches moins pratiques en contexte d’optimisation chimique. Pour relever ce défi, nous avons développé une plateforme « RMN pour la RSA » (relation structure-activité) qui repose en grande partie sur des méthodes de RMN basés sur la détection de ligand qui contournent le besoin d'utiliser des concentrations élevées de ligand pour détecter de faibles liaisons intermoléculaires. Des scores de liaison sont extraits des données acquises utilisant des points de concentration uniques (plutôt que des titrages), ce qui permet un classement en fonction des affinités de liaison relatives et ainsi guider les efforts de chimie médicinale. Le comportement des composés en solution, de même que la protéine sont aussi soigneusement surveillés en parallèle. Nous démontrons notre plate-forme RMN pour la RSA avec la cible protéique oncogène HRas comme une preuve de concept dans laquelle des ligands de qualité d’affinités de l’ordre du micromolaire / nanomolaire ont été développés à partir d’un fragment d'environ 10 millimolaire.

La détection de ligands par RMN du fluor (19F), en particulier des ligands de faibles affinités, peut nécessiter des interprétations de changements mineurs dans les déplacements chimiques. Ainsi, le référencement du déplacement chimique est essentiel pour l’interprétations de tels changements. Malheureusement, aucune ligne directrice n'existe quant au choix des références chimiques internes en conditions aqueuses. Dix composés candidats potentiels pouvant servir de références chimiques RMN 19F ont donc été évalués. Plusieurs paramètres ont été systématiquement évalués afin de déterminer la pertinence de ces candidats pour des fins de criblage par RMN 19F. Il a été conclu qu'il n'y avait pas de candidat idéal parmi les molécules testées, mais cinq composés pourraient tout de même convenir au criblage par RMN.

On a longtemps supposé que les faibles puissances des fragments les rendraient incompatibles avec le criblage cellulaire. Néanmoins, l’utilisation de chimiothèques de fragments pourraient présenter plusieurs avantages en contexte de criblage phénotypique. Nous avons donc appliqué une approche phénotypique de découverte de pistes basée sur des fragments (FPLD, fragment-based phenotypic lead discovery) contre divers modèles de maladies tels que des parasites, des bactéries et des virus afin de déterminer si cela aboutit à une identification fructueuse de composés touches. Des tendances RSA préliminaires ont été observées, soutenant l'idée que les effets ne sont pas simplement dus à la promiscuité et que le FPLD représente une approche intéressante pour lancer des projets de découverte de médicaments, en particulier pour les maladies plus complexes qui ne possèdent pas de cibles moléculaires bien validées.

Fragment-based lead discovery (FBLD) has gained in popularity over recent decades as a drug discovery approach. Due to their lower molecular weight and complexity, fragments can probe greater portion of chemical space and therefore necessitate significantly smaller libraries, making it much more accessible to smaller institutions. Fragments approaches are also increasingly used against difficult targets where less tractable binding pockets cannot always be probed with classical methods.

However, detection of weaker affinity fragment binders frequently requires high ligand concentrations which increases risks of artifacts due to compound self-aggregation. We therefore validated the use of an nuclear magnetic resonance (NMR) T2-CPMG experiment to detect compound aggregation. The method is versatile and amenable to high-throughput, allowing monitoring of solution behavior in parallel to screening.

Another challenge in drug discovery is how to rank compound affinities to guide chemical optimization of these compounds. NMR is frequently used for fragment screening, as it is sensitive to weak affinity binding events. However, standard NMR methods for binding affinity determination require the use several titration points which makes such approaches less practical for chemical optimization. To address this challenge, we have developed an “NMR for SAR” (structure-activity relationship) platform that is centered on ligand-detected NMR methods which circumvent the need to use high ligand concentrations to detect weak binding. Binding scores are extracted from single concentration points, allowing rank ordering of compounds according to their relative binding affinities in order to guide medicinal chemistry efforts. Compound free-state behavior, as well as the protein are surveyed in parallel. We demonstrate our NMR for SAR platform with the oncogenic HRas protein as a proof of concept in which quality micromolar/nanomolar binders were developed from an initial ~10 millimolar fragment screening hit.

The detection of ligand binding by fluorine (19F) NMR, especially those with weak affinities, can require interpretations of minor changes in chemical shifts. Thus, chemical shift referencing is critical for accurate measurements and interpretations. Unfortunately, no guidelines exist as to the choice of internal chemical references in aqueous solutions. Ten potential candidate compounds that could serve as 19F NMR chemical references were therefore evaluated. Multiple parameters were systematically evaluated to monitor suitability of these candidates for 19F NMR screening purposes. It was concluded that there was no ideal candidate, but five compounds were identified that could be suitable for NMR screening.

It has long been assumed that the low potencies of fragments would make them incompatible with cell-based screening. Nonetheless, the use of fragment libraries in phenotypic screening context could hold several advantages. We therefore applied a fragment-based phenotypic lead discovery (FPLD) approach against various disease models such as parasites, bacteria and viruses in order to determine if this resulted in successful identification of hit compounds. Early SAR trends were observed, supporting the idea that the effects are not simply due to promiscuity and that FPLD represents an interesting approach, especially for more complex diseases that often lack well-validated molecular targets.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Laplante, Steven
Mots-clés libres:	Découverte de médicaments; auto-agrégation de composés; criblage par fragment; résonance magnétique nucléaire; plateforme biophysique; Ras; référence de fluor; criblage phénotypique; maladies infectieuses; Drug discovery; compound self-aggregation; fragment screening; nuclear magnetic resonance; fluorine reference; phenotypic screening; infectious diseases
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	09 juill. 2024 15:36
Dernière modification:	09 juill. 2024 15:36
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15808

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