Étude structure fonction de la protéine cellulaire upstream binding factor et son impact sur la réplication du HSV-1

Sleimi, Wiem (2023). Étude structure fonction de la protéine cellulaire upstream binding factor et son impact sur la réplication du HSV-1 Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 60 p.

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Résumé

Le virus herpès simplex 1 (HSV-1) est un virus enveloppé à ADN double brin. Ce virus cause typiquement des lésions orales qui se résorbent d’elles-mêmes, mais cet agent pathogène peut également induire des kératites oculaires et, dans de rares cas, des encéphalites sévères.

Dans la cellule infectée par le HSV-1, la protéine cellulaire Upstream Binding Factor (UBF) se relocalise du nucléole vers les compartiments de réplication virale. UBF est un facteur de transcription dont la principale fonction est d’activer la transcription des gènes ribosomaux par l’ARN polymérase I. Notre laboratoire a découvert que UBF colocalise avec l’ADN viral de HSV-1 et affecte négativement sa réplication ainsi que sa transcription. Ainsi, UBF fait partie de la réponse antivirale intrinsèque de la cellule. L’hypothèse que nous avons émise est que les résidus nécessaires pour l’activité transcriptionnelle de UBF sont importants pour son activité antivirale.

L’objectif global de ce projet était d’effectuer une analyse structure-fonction de UBF afin d’identifier les acides aminés critiques pour sa fonction antivirale, en se focalisant sur des résidus qui ont été démontrés comme étant importants pour son activité transcriptionnelle.

Une stratégie de mutagenèse dirigée a été utilisée pour créer une banque de gènes UBTF mutés codant pour des substitutions d’acides aminés dans la protéine. Des sites de modification post-traductionnelle ont été ciblés (e.g. site de phosphorylation, site d’acétylation, site de méthylation). La mutation "E210K", associée à une maladie neurodégénérative rare, a également été testée. Nous avons généré les mutations suivantes : T201A ; S389A ; S412A ; S484A ; K232A ; K254A ; K352A et E210K, connues pour affecter l’activité transcriptionnelle d’UBF. L’expression des différentes formes d’UBF a été vérifiée par Western blot dans le cadre de transfection transitoire de la lignée épithéliale humaine HeLa.

Les formes mutées d’UBF ont été exprimées de manière ectopique dans un contexte d’infection de cellules épithéliales pour savoir si la mutation affecte la capacité inhibitrice d’UBF. La formation des compartiments de réplication virale de HSV-1 a été suivie par microscopie confocale en observant le marquage de l’ICP8, une protéine virale qui lie l’ADN simple brin.

Parmi les différentes mutations testées, seule la mutation du site d’acétylation K352 a induit une différence significative d’activité inhibitrice par rapport à l’UBF de type sauvage.

La substitution de la lysine 352 par l’alanine a maintenu la formation des compartiments de réplication virale, abolissant ainsi l’inhibition de la réplication du HSV-1 par l'UBF. Cette mutation est également associée à une réduction de la transcription des gènes ribosomiques.

Ces observations suggèrent que le site d’acétylation en position 352, essentiel pour l’activité transcriptionnelle de l’UBF, joue également un rôle crucial dans son activité antivirale.

Cette découverte contribue à une meilleure compréhension du mécanisme mis en oeuvre par l’UBF pour inhiber la réplication du HSV-1. Une telle compréhension pourrait avoir des implications importantes dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques contre le HSV-1.

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an enveloped, double-stranded DNA virus. This virus typically causes self-resorbing oral lesions, but this pathogen also has the potential to induce ocular keratitis and, in rare cases, severe encephalitis.

In HSV1-1 infected cells, the cellular protein Upstream Binding Factor (UBF) relocates from the nucleolus to viral replication compartments. UBF is a transcription factor whose main function is to activate the transcription of ribosomal genes by RNA polymerase I. Our laboratory has discovered that UBF colocalizes with HSV-1 viral DNA and impairs both its transcription and replication. Thus, UBF is a component of the cell's intrinsic antiviral defense. According to our hypothesis, the residues essential for UBF’s transcriptional activity are crucial for its antiviral activity.

The overall goal of this project was to conduct a structure-function analysis of UBF in order to pinpoint the amino acids necessary for its antiviral function, with a particular emphasis on residues that have been demonstrated to be important for its transcriptional activity.

A site-directed mutagenesis strategy was used to create a library of mutated UBTF genes encoding amino acid substitutions in the protein. Post-translation modification sites were targeted (e.g., phosphorylation site, acetylation site, methylation site). The “E210K” mutation, associated with a rare neurodegenerative disease, was also tested. We generated the following mutations: T201A; S389A; S412A; S484A; K232A; K254A; K352A and E210K, which are known to affect UBF’s transcriptional activity. The expression of different UBF forms was verified by Western blot in the context of transient transfection of the human epithelial cell line HeLa.

To find out whether the mutation affects UBF's ability to suppress infection in epithelial cells, mutated forms of the protein were ectopically expressed in HeLa cells. Confocal microscopy was used to monitor the formation of HSV-1 viral replication compartments by observing ICP8 labeling, a viral protein binding single-stranded DNA.

Among the various mutations tested, only the acetylation site mutation K352 resulted in a significant difference in inhibitory activity compared to wild-type UBF. The substitution of lysine 352 with alanine preserved the formation of viral replication compartments, thus abolishing the inhibition of HSV-1 replication by UBF. This mutation is also associated with a reduction in ribosomal gene transcription.

These observations suggest that the acetylation site at position 352, crucial for UBF's transcriptional activity, also plays a crucial role in its antiviral activity.

This discovery contributes to a better understanding of the mechanism employed by UBF to inhibit HSV-1 replication. Such understanding could have significant implications in the development of new therapeutic approaches against HSV-1.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Pearson, Angela
Mots-clés libres:	HSV-1 ; UBF ; réponse antivirale ; interaction hôte-virus ; High Mobility Group ; HMG; herpesvirus; antiviral response; host-virus interaction; high mobility group
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	09 juill. 2024 15:34
Dernière modification:	09 juill. 2024 15:34
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15799

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