Characterization of a Novel Hyaluronate Lyase Secreted by Helicobacter pylori

Beniani, Meriem (2023). Characterization of a Novel Hyaluronate Lyase Secreted by Helicobacter pylori Mémoire. Québec, Université du Québec . Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 67 p.

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Résumé

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Helicobacter pylori is one of the most performant human pathogenic bacteria that cause chronic gastric inflammation leading to duodenum ulcers as well as stomach cancer. Unlike other neutralophilic bacteria that can only survive stomach acidity, this organism expresses acid-adaptive genes that enables it to colonize this acidic environment. The purpose of my master project was to characterize and determine the function of HP0304, a protein produced by H. pylori. The protein structure has been elucidated at 2.2 Å resolution revealing a typical alginate lyase fold. I have determined that HP0304 is capable of degrading hyaluronan and chondroitin sulfate A at pH 5 and 7 by the 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay. By the enzymatic assay consisting of measuring the change in absorbance at 235 nm, it was determined that the specific activity of HP0304 peaked at pH 5 suggesting that this protein can function in the gastric environment. To continue, it was found that the degradation of hyaluronan and chondroitin sulfate A are both dependent on the concentration of NaCl. The maximum velocity (Vmax) and the Michaelis constant Km, for hyaluronan degradation were determined to be 0.67 ± 0.10 mM Δ235 nm min-1 and 3.91 ± 0.92 mM respectively at pH 5. HP0304 was found to be a lyase specific to hyaluronan degradation at pH 5, since its specific activity of 634 ± 92.2 units/mg is considerably higher than the specific activities of chondroitin sulfate A at pH 5 and 7, which were found to be, respectively, 75.4 ± 5.42 units/mg and 99.2 ± 13.8 units/mg. The mutant Y213F of HP0304 was generated by site directed mutagenesis and was found to have an activity of 22.3 ± 0.17 % relative to the wild type. By flow cytometry, it was determined that after 2 hours, 97% of the human gastric adenocarcinoma (AGS) cells interacted with HP0304. However, to confirm that this interaction is specific we will need to perform a negative control. Using confocal microscopy and live imaging, it was observed that as time passes the protein of interest is accumulated within the cytoplasm of AGS cells. Measurement by qPCR of pro-inflammatory cytokines IL-8 and TNF-α mRNA expression by AGS cells following their incubation for 24 hours with HP0304 and lipopolysaccharide (LPS) yielded results below the 2-fold change set threshold. Overall, I have successfully determined that HP0304 is a hyaluronate lyase produced by H. pylori, but the possible effects of this enzyme on the gastric mucosa and whether it plays a role or not in H. pylori’s acid adaptation are still unknown and need to be researched on.

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H. pylori est l'une des bactéries pathogènes les plus performantes qui provoquent une inflammation gastrique chronique conduisant à des ulcères du duodénum ainsi qu' au cancer de l'estomac. Contrairement aux autres bactéries neutralophiles qui ne peuvent que survivre face à l'acidité de l'estomac, H. pylori exprime des gènes adaptatifs à l'acide qui lui permettent de coloniser cet environnement acide. Le but de mon projet de maîtrise était de caractériser et de déterminer la fo nct ion de HP0304 , une protéine pro dui te par H. pylori . La structure de celle ci a été élucidée à une résolution de 2,2 Å révélant un repliement d alginate lyase de la famille PL5 . Nous avons déterminé que HP0304 est capable de dégrader l' acide hyaluro nique et le sulfate de chondroïtine A à pH 5 et 7 par le test 3, 5 dinitrosalicylic acid (DNS) DNS). P ar le test enzymatique mesurant la variation d'absorbance à 235 nm, il a été déterminé que l'activité spécifique de HP0304 culminait à pH 5 suggérant que cette protéine peut fonctionner dans le milieu gastrique. Pour continuer, il a été constaté que la dégradation de l’acide hyaluronique et de la chondroïtine sulfate A dépendent de la concent ration en NaCl. Les paramètres cinétiques, V max et K m , pour la dégradation de l’ acide hyaluronique obtenu sont respectivement 0 67 0 10 Δ235 nm min 1 et 3,91 0 92 m M à pH 5. HP0304 s'est avéré être une lyase spécifique à la dégradation de l'hyaluronan e à pH 5, puisque son activité spécifique de 634 ± 92, 2 unit és /mg est nettement supérieure aux activités spécifiques de la chondroïtine sulfate A à pH 5 et 7, qui ont été trouvé être respective ment, 75, 4 5,42 unit és /mg et 99,2 13,8 unit és /mg . Le mutant Y213F de HP0304 a été généré par mutagenèse dirigée et s'est avéré avoir une activité de 22, 3 ± 0,17 % par rapport au type sauvage. Par cytométrie en flux, il a été déterminé qu'après 2 heures, 97% des cellules adénocarcinomes gastriques humai ne s AGS interagissaient avec HP0304. Cependant, pour confirmer que cette interaction est spécifique, nous dev r ons effectuer un contrôle négatif. En utilisant la microscopie confocale et l’ imagerie en direct, il a été observé qu'au fil du temps, la protéine d'intérêt s'accumule dans le cytoplasme des cellules AGS. La mesure par qPCR de l'expression de l'ARNm des cytokines pro inflammatoires IL 8 et TNF α après leur incubation pendant 24 heures avec HP0304 et le l ipopolysaccharide LPS a donné des résultats infér ieurs au seuil de 2 définit pour le fold change. Dans l'ensemble, j’ai réussi à déterminer que HP0304 est une hyaluronane lyase produite par H. pylori , mais les effets possibles de cette enzyme sur la muqueuse gastrique et son rôle dans l'adaptation acide de H. pylori sont encore inconnus et doivent être étudiés.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Clamettes, Charles
Mots-clés libres:	H. pylori; HP0304; Acid adaptation; Protein characterization; DNS assay; Enzymatic assay; Kinetic parameters; Site directed mutagenesis; Flow cytometry; Confocal microscopy; Live-cell imaging and RT-qPCR; test DNS; Test enzymatique; Paramètres cinétiques; Mutagénèse dirigée; Cyrtométrie en flux; Microscopie confocale et RT qPCR
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	09 juill. 2024 15:33
Dernière modification:	09 juill. 2024 15:33
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15794

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