ARN non codants régulateurs en cis et riboswitchs : développement de méthodes et caractérisation exploratoire

Devinck, Aurélie (2023). ARN non codants régulateurs en cis et riboswitchs : développement de méthodes et caractérisation exploratoire Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 232 p.

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Résumé

Au cours des dernières décennies de nouvelles classes d’ARN ont été découvertes. Celles-ci ne contiennent pas d’informations permettant la synthèse de protéines mais ont des fonctions régulatrices. De nombreuses études ont permis de montrer leur importance dans le maintien de l’homéostasie de la cellule, mais aussi pour leur adaptation à l’environnement. Ces sont les ARN non codants (ARNnc). Ils sont classés en différentes catégories à savoir les ARN en trans, qui sont transcrits de manière indépendante par rapport à leur cible, ou les ARN en cis, qui eux sont situés à proximité de leur cible voire sur le même ARN messager (ARNm). Ce sont ces derniers qui nous intéresseront dans le cadre de cette thèse de doctorat.

Certaines structures d’ARN complexes sont situées dans les parties 5' non traduites des ARNm et permettent de réguler l’expression du gène situé directement en aval. On peut en distinguer plusieurs catégories en fonction du stimulus permettant sa fonction, comme les thermorégulateurs, les T-box, les r-leader ou encore les riboswitchs. La plupart des ARNnc en cis ont été découverts grâce à des méthodes de bioinformatique basées sur des comparaisons de structures. Cependant, ces méthodes présentent des limites. Elles permettent de prédire de nombreuses structures qui ont la nécessité d’être validées expérimentalement. Ceci crée un déséquilibre dans la caractérisation de ces ARN entre les bactéries disposant de nombreux outils génétiques, comme Escherichia coli et Bacillus subtilis et celles en ayant moins comme Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia thailandensis. Nous avons ainsi développé au laboratoire, un plasmide nommé pVK-f2.2-lux permettant de faire des fusions traductionnelles entre des ARNnc prédits et un opéron permettant de produire de la luminescence. Ceci nous a permis de caractériser l’importance de la structure de six ARNnc prédits chez Pseudomonas pour permettre la régulation du gène situé en aval de ceux-ci. Afin de pallier à une autre limite des outils de bioinformatique, nous avons développé une méthode expérimentale pour la découverte de nouveaux riboswitchs. Cette méthode est basée sur la caractéristique principale des riboswitchs à changer de conformation en présence de leur ligand, provoquant un changement de migration dans un gel de polyacrylamide natif. Cette méthode a été validée grâce à des riboswitchs connus et nous a permis de sélectionner un riboswitch avec une affinité modifiée pour son ligand grâce à un SELEX (Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment).

During the last decades new classes of RNA have been discovered. These do not contain information for protein synthesis but have regulatory functions. Numerous studies have shown their importance in the maintenance of cell homeostasis, but also for their adaptation to the environment. These are the non-coding RNAs (ncRNAs). They are classified in different categories, namely RNAs in trans, which are transcribed independently from their target, or RNAs in cis, which are located near their target or on the same messenger RNA (mRNA). These are the ones that will interest us in this PhD thesis.

Some complex RNA structures are located in the 5' untranslated parts of the mRNAs and allow to regulate the expression of the gene located directly downstream. Several categories can be distinguished depending on the stimulus allowing its function, such as thermoregulators, T-boxes, r-leaders or riboswitches. Most of the cis-regulatory RNAs discovered have been discovered using bioinformatics tools based on structure comparisons. However, these methods have some limitations. They predict many structures that need to be validated experimentally. This creates an imbalance in the characterization of these RNAs between bacteria with many genetic tools, such as Escheriachia coli and Bacillus subtilis, and those with fewer such as Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia thailandensis. We have thus developed in the laboratory a plasmid named pVK-f2.2-lux allowing translational fusions between predicted ncRNAs and an operon that allows luminescence production. This allowed us to characterize the importance of the structure of six predicted ncRNAs in Pseudomonas to allow regulation of the gene located downstream of them. In order to overcome another limitation of bioinformatics tools, we have developed a new experimental method for the discovery of new riboswitches. This method is based on the main characteristic of riboswitches to change their conformation in the presence of their ligand causing a migration change in a native polyacrylamide gel. This method was validated with known riboswitches and we were able to select a riboswitch with a modified affinity for its ligand using SR-PAGE with a SELEX (Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment).

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Perreault, Jonathan
Mots-clés libres:	rmf; sucA-II; Pseudomon-Rho; rne-II; fixA; Pseudomon-GGDEF; ppGpp; di-GMPc; électrophorèse; TPP; electrophoresis
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	01 juill. 2024 14:13
Dernière modification:	01 juill. 2024 14:13
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15789

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