Development of rolling circle amplification based biosensing technologies

Hamidi, Seyed Vahid (2021). Development of rolling circle amplification based biosensing technologies Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 144 p.

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Résumé

Les maladies infectieuses sont l'une des principales causes de mortalité humaine et animale. La propagation de maladies infectieuses parmi la faune et les animaux domestiques menace la production animale, l'approvisionnement alimentaire et a également un impact sur la biodiversité environnementale et mondiale. Les gouvernements dépensent beaucoup d’argent pour les soins de santé publics et à ce titre, la surveillance des maladies peut avoir un rôle majeur pour la prévention afin de réduire les risques pour la santé et aussi pour réduire les dépenses publiques en santé. Un exemple actuel evident de l’importance d’un tel suivi est bien illustré par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), responsable de la COVID- 19.

La méthode standard pour la détection et l'identification des maladies infectieuses telles que le virus de la grippe et le coronavirus est la PCR quantitative (qPCR). La qPCR est une méthode de laboratoire qui nécessite un thermocycleur en temps-réel, qui est coûteux et sophistiqué, ainsi que du personnel de laboratoire formé pour effectuer de tels tests. D'autres méthodes alternatives, y compris le dosage immuno-enzymatique conventionnel (ELISA) et les méthodes basées sur la culture cellulaire, nécessitent également des laboratoires équipés pour effectuer les tests. Par conséquent, le développement d'une méthode simple, sensible, portable, rapide et surtout sans instrumentation, pour la surveillance des maladies infectieuses sur le terrain est très important pour le dépistage rapide des virus et la gestion de la situation en cas de pandémie.

L'amplification en cercle roulant (RCA) est une technique d'amplification d'ADN isotherme biomimétique et en raison de sa robustesse et de sa simplicité, elle peut rivaliser avec les autres méthodes d'amplification isotherme de l'ADN, comme l'amplification isotherme à médiation en boucle (LAMP). La RCA est une réaction de polymérisation d'ADN isotherme qui génère un ADN simple brin à partir d'une courte matrice d'ADN circulaire. Contrairement à la réaction en chaîne par polymérase (PCR) qui nécessite un thermocycleur et une ADN polymérase thermostable, la technique RCA est isotherme et la polymérisation se produit à une température plus basse (25- 65 ° C selon les enzymes choisies). La technique a d'abord été menée pour la détection ultrasensible de cibles ADN et a aussi été combinée à toutes sortes de plates-formes pour la détection très sensible des cibles diverses.

Ici, plusieurs biocapteurs basés sur RCA ont été développés pour la détection de maladies infectieuses en utilisant différentes plates-formes, y compris des plates-formes colorimétriques et optiques. En outre, une nouvelle méthode a été proposée pour la génération d'ADN linéaire et circulaire monocaténaire in vitro en raison des vastes applications dans le domaine de la biologie moléculaire, en particulier dans la procédure du SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). De plus, cette nouvelle technique est utilisée pour la sélection d'aptamères linéaires et circulaires contre le coronavirus du Moyen-Orient (MERS CoV). Voici les principaux objectifs de cette thèse: i) développer une nouvelle technologie colorimétrique basée sur RCA pour la détection simple des maladies infectieuses en utilisant le rouge de phénol comme colorant sensible au pH. ii) Couplage de RCA avec d'autres plates-formes sensibles, y compris la technologie de microcavité optique, comme nouveau moyen de détection sensible des biomarqueurs. iii) Développer une nouvelle technique de préparation in vitro d'ADN simple brin linéaire et circulaire (ADNsb). Dans le cadre de l'objectif iii, cette nouvelle technique a été utilisée pour la sélection d'aptamères linéaires et circulaires contre le MERS-CoV.

Le premier objectif de cette thèse, une méthode colorimétrique simple est développée pour la détection spécifique du virus de la grippe H5N1 en utilisant le rouge de phénol comme colorant sensible au pH. Tout d'abord, suite à l’optimisation les paramètres expérimentaux, la performance de la réaction de ligature dans une solution sans tampon (sans Tris-HCl), a été évaluée avec succès, de même que sa sélectivité. Ces travaux ont été publiée dans le journal Talanta. Cette technique conviviale a l’avantage d’être simple, portable et de ne requérir aucune instrumentation due à nature isotherme.

Le deuxième objectif a été réalisé en collaboration avec le laboratoire de photonique de l'Université du Québec en Outaouais. Dans cette étude en couplant deux techniques puissantes, y compris l'interféromètre de Mach Zehnder en ligne à microcavité optique (μIMZI), une plateforme de détection ultra-sensible a été développée pour la surveillance en temps réel des maladies infectieuses et en particulier du virus de la grippe H5N1 (l'objet de cette étude). Ce biocapteur à base de uIMZI fournit une amplification d'ADN dans un volume aussi bas que le picolitre où la réaction RCA est initiée à partir des amorces immobilisées dans la cavité. Cela a conduit à la large plage linéaire de 283 et 2 830 000 copies cibles H5N1 et à une limite de détection (LOD) très basse de 6 copies. Ce travail est publié dans le journal Lab on a Chip.

Dans le cas de l'objectif 3, une nouvelle méthode de préparation in vitro d'ADNsb linéaire et circulaire a été introduite. Bien qu'il existe plusieurs méthodes pour préparer l'ADNsb linéaire à partir de produits, la production d'ADNsb circulaire est toujours un défi. Dans ce travail, en utilisant des modifications dérivées du phosphore, à savoir des liaisons phosphorothioate et des modifications de phosphorylation et en utilisant l'enzyme exonucléase Lamda conventionnelle, la préparation d'ADNsb circulaire à partir d'un produit de PCR a été simplifiée. Cette méthode peut servir pour des applications telles que le SELEX ou la préparation de PLP basée sur PCR, la préparation de bibliothèque pour séquençage, etc. Les résultats de ce travail seront soumis prochainement pour un troisième article. De plus, pour vérifier les performances de la méthode proposée, 15 cycles de SELEX ont été effectués pour la sélection des aptamères linéaires et circulaires par rapport au MERS CoV.

One of the leading causes of human and animal death is infectious diseases. The propagation of infectious diseases among wildlife and domestic animals threatens animal production, food supply and have impacts on the environmental and global biodiversity as well. Governments are spending lots of money on the public healthcare and, in that regard, monitoring of diseases and pathogens can have a major role in prevention to reduce risks for health and decrease the governments’ expenses on the public health-care. Also, viral infection of animal population endangers the global public health by introduction of new versions of pandemic viral strain and sporadic human zoonotic infections in view of the fact that animals are regarded to be the cause of about 70% of all emerging infections. An obvious current example of the importance of such monitoring is illustrated by the pandemic of Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2 (SARS-CoV-2).

The gold standard method for detection and identification of infectious diseases such as influenza virus and coronavirus is quantitative PCR (qPCR). qPCR is a lab-based method and it needs an expensive and sophisticated real-time thermal cycler machine as well as trained lab staff members to do such tests. Other alternative methods including conventional enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and cell culture-based methods also lab need equipped labs to perform the tests. Therefore, developing a simple, sensitive, portable, rapid and more importantly instrumentation-free method for in field infectious disease monitoring is very important for fast screening of the viruses and managing of the situation in case of pandemic.

Rolling circle amplification (RCA) is a biomimetic isothermal DNA amplification technique and because of its robustness and simplicity, it can compete with the other isothermal DNA amplification methods, like loop mediated isothermal amplification (LAMP). RCA is an isothermal DNA polymerization reaction that generate single strand DNA from short circular DNA template. In contrast to PCR which needs thermal cycler and thermostable DNA polymerases, the RCA technique is isothermal, and polymerization occurs at lower temperature (25-65˚C depending on chosen enzymes). The technique was first conducted to ultra-sensitive detection of DNA targets and also combined to all sorts of platform for highly sensitive detection of targets.

Herein, several RCA based biosensors have been developed for detection of infectious disease using different platforms including colorimetric and optical platforms. In addition, a novel method was proposed for in vitro single stranded linear and circular DNA generation due to the broad applications in molecular biology field especially in SELEX procedure. Moreover, this novel technique is used for linear and circular aptamer selection against middle east corona virus (MERS CoV). Here are the main objectives for this PhD thesis: i) developing a new RCA based colorimetric technology for simple detection of infectious diseases using phenol red as a pH sensitive dye. ii) Coupling RCA with other sensitive platforms including optical microcavity technology as a novel way for sensitive detection of biomarkers. iii) Developing a new technique for in vitro preparation of linear and circular single stranded DNA (ssDNA). As a part of objective iii, this novel technique was used for selection of linear and circular aptamers against MERS-CoV.

In the first objective of this thesis, a simple colorimetric method was developed for specific detection of H5N1 influenza virus using phenol red as a pH sensitive dye. Following optimization, performance of ligation reaction in buffer free solution (without Tris-HCl) was successful and showed excellent selectivity. This work was published in Talanta. This user-friendly technique is simple, portable and does not require instrumentation due to its isothermal nature.

The second objective was performed in collaboration with the photonics lab at Université du Québec en Outaouais. In this study by coupling two powerful techniques including RCA and optical microcavity in-line Mach Zehnder interferometer (μIMZI), an ultra-sensitive detection platform was developed for real-time monitoring of infectious disease and particularly H5N1 influenza virus (the focus of this study). This μIMZI based biosensor provides DNA amplification in a volume of as low as picoliter where RCA reaction is initiated from the immobilized primers in the cavity. This led to the wide linear range form 283 and 2 830 000 H5N1 target copies and very low limit of detection (LOD) of 6 copies. This work was published in Lab on a Chip.

In case of objective 3, a novel method for in vitro preparation of linear and circular ssDNA was introduced. Although there are several methods for preparing linear ssDNA from products, producing circular ssDNA is still challenging. In this work by employing phosphor derived modifications namely phosphorothioate bonds and phosphorylation modifications and using conventional Lamda exonuclease enzyme, circular ssDNA preparation from PCR product have been simplified. This method can be used for applications such as SELEX, PLP preparation, library preparation for sequencing, etc. The results of this work will be submitted for a third article. In addition, to verify the performance of the proposed method 15 cycles of SELEX have been done for linear and circular aptamer selection against MERS-CoV.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Perreault, Jonathan
Mots-clés libres:	Amplification en cercle roulant; Biocapteurs; détection colorimétrique; Microcavités optiques; préparation ADNsb circulaire; SELEX; Rolling circle amplification; Biosensors; colorimetric detection; Optical microcavities; circular ssDNA preparation
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	01 juill. 2024 14:12
Dernière modification:	01 juill. 2024 14:12
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15781

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