Étude de la relation structure-fonction flexibilité de glycoside hydrolases des familles 11 et 12 chez Streptomyces lividans

Roux, Louise D. (2018). Étude de la relation structure-fonction flexibilité de glycoside hydrolases des familles 11 et 12 chez Streptomyces lividans Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en Microbiologie Appliquée, 85 p.

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Résumé

Les xylanases sont des enzymes qui catalysent le clivage hydrolytique de la liaison glycosidique de xylanes, des hémicelluloses que l’on retrouve principalement dans les parois cellulaires des plantes et des algues. Malgré les nombreux efforts dévoués à l’amélioration catalytique des xylanases à des fins d’ingénierie enzymatique, en particulier pour leur utilisation industrielle, la compréhension restreinte de leurs propriétés moléculaires limite les progrès biotechnologiques. Les premières études structurales de plusieurs xylanases de la famille 11 (GH11) ont proposé l'existence d'un mouvement « ouvert-fermé » via une boucle près du site actif (le « pouce »), qui semble jouer un rôle dynamique majeur dans la liaison au substrat, la libération du produit et/ou la catalyse. Dans le but de vérifier cette hypothèse et de tester l’importance fonctionnelle de la dynamique de cette enzyme à l’échelle de temps de son événement catalytique (millisecondes), nous avons entrepris une étude de changements conformationnels chez la xylanase B2 de Streptomyces lividans à l’aide d’expériences de dispersion de relaxation (¹⁵N-CPMG) en spectroscopie RMN. Pour tester la conservation évolutive d’événements dynamiques impliqués dans la catalyse chez cette famille d’enzymes, nous avons également entrepris des analyses semblables chez un homologue structural de XlnB2, à savoir la xylanase C (XlnC) de S. lividans, qui possède 77 % d’identité de séquence et une activité catalytique similaire à XlnB2. Nos données préliminaires semblent suggérer que XlnC ne montre pas d’échange conformationnel dans sa forme libre, alors que la présence du ligand xylobiose (X2) induit l’apparition d’un nombre restreint de résidus qui subissent des mouvements à cette échelle de temps. De manière analogue, la cellulase B2 (CelB2) de S. lividans a également été étudiée pour sa structure similaire à celle des GH11 et son absence de boucle en forme de « pouce ». Tout comme chez XlnC, les premiers résultats obtenus avec CelB2 semblent indiquer que cette enzyme ne présente pas d’échange conformationnel à l’échelle de temps de la milliseconde. Nos résultats laissent entrevoir que cette famille d’enzymes dépend de profils dynamiques distincts, qui pourraient à la fois être tributaires de la présence ou de l’absence de domaines de liaison aux sucres et/ou de différents profils de reconnaissance et d’affinité envers divers substrats. Nos données démontrent que les repliements protéiques ne peuvent être systématiquement considérés équivalents au niveau de leur potentiel d’adaptation en ingénierie enzymatique, malgré leur forte similarité de séquence, de structure et de fonction. Ces résultats ouvrent la voie à une meilleure compréhension moléculaire de l’utilisation, de la modification et de la modulation d’activités enzymatiques en ingénierie des protéines.

Xylanases are enzymes that catalyze the hydrolytic breakdown of glycosidic bonds in xylan, a group of hemicelluloses found in the cell walls of plants and algae. Despite many efforts devoted to the catalytic improvement of xylanases ¾ particularly for their industrial use ¾ limited understanding of their molecular properties currently limits their biotechnological function. Previous structural studies performed on several family 11 xylanases (GH11) proposed the existence of an “open-closed” movement occurring via a loop near the active site (i.e. the “thumb loop”), which appears to play a major dynamic role in substrate binding, product release and/or catalysis. To test this hypothesis and to investigate the functional importance of enzyme flexibility occurring on the time scale of catalysis in xylanases (i.e. milliseconds), we performed conformational exchange studies of xylanase B2 from Streptomyces lividans using ¹⁵N-CPMG relaxation dispersion NMR spectroscopy. To examine the potential evolutionary conservation of dynamic events involved in catalysis within this enzyme family, we also examined structural homologs of XlnB2, primarily focusing on xylanase C (XlnC) from S. lividans, which conserves 75 % sequence identity with XlnB2 and displays similar catalytic activity. Our preliminary data suggests that XlnC does not exhibit conformational exchange in its free form, whereas the presence of a xylobiose (X2) ligand induces conformational exchange on a limited number of residues. Similarly, cellulase B2 (CelB2) from S. lividans was also investigated for its analogous structure and absence of a “thumb loop”. Similar to XlnC, preliminary results on CelB2 indicate that this enzyme does not experience conformational exchange on the millisecond time scale. Our results suggest that this enzyme family relies on distinct dynamic profiles, which may depend on the presence or absence of sugar binding domains and/or different recognition and affinity patterns towards various substrates. Our data demonstrate that protein folds cannot systematically be considered equivalent in terms of potential for enzymatic engineering adaptation, despite their strong similarity in sequence, structure and function. These results pave the way for a better molecular understanding of the use, modification, and modulation of enzymatic activities in protein engineering.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Doucet, Nicolas
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	01 juill. 2024 14:10
Dernière modification:	01 juill. 2024 14:10
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15775

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