Assessing the role of two beta-defensins on human sperm motility and maturation

Aram, Raheleh (2018). Assessing the role of two beta-defensins on human sperm motility and maturation Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 168 p.

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Résumé

A crucial function of the epididymis is providing a surface glycocalyx that encapsulates maturing spermatozoa. The glycocalyx may be important for sperm maturation and capacitation. Defensins are a family of cationic antimicrobial peptides, which several of them are expressed in epididymis. β-defensin 126 (DEFB126) and sperm-associated antigen SPAG11B are two epididymal β-defensins, which their important roles in sperm maturation and capacitation have been demonstrated in different species. In men who are azoospermic, sperm can be retrieved from testes, which are immature and immotile. While in vitro sperm maturation can provide a better fertilizing capacity for intracytoplasmic sperm injection in these patients.

In this project, as the first objective, the expression, localization and mRNA levels of DEFB126 and SPAG11B in efferent ducts and epididymis of nonobstructive azoospermia patients (NOA) were compared with fertile men. Immunohistochemistry assays indicated no significant differences in the expression of DEFB126 and SPAG11B in efferent duct and throughout the epididymis in fertile and NOA patients. However, the expression of SPAG11B and the mRNA levels of SPAG11B isoform D in the cauda epididymides of NOA patients were detected significantly lower than fertile men.

As a second objective, DEFB126 correlation with sperm maturation in humans was determined. Immunofluorescence experiments associated with motility test (swim up test) showed that the proportion of positive sperm for DEFB126 were remarkably higher in motile spermatozoa. Complementary experiments in different patients indicated that the proportion of DEFB126-labeled spermatozoa is positively correlated with the percentage of sperm motility and normal morphology. Additional studies indicated that the proportion of DEFB126-positive spermatozoa in fertile patients was significantly higher than in patients with varicocele, and in infertile patients (semen deficiencies).

To determine the role of DEFB126 on sperm motility, the DEFB126 gene was cloned and used to generate recombinant DEFB126 in H9C2 cells. Deletion mutations were created into two regions of the protein, which have been linked to male infertility. Immotile testicular spermatozoa were incubated with cells expressing the different forms of DEFB126. Full-length DEFB126 increased motility of co-cultured spermatozoa by 15%. However, no increase in sperm motility was observed with the mutated forms of DEFB126.

In conclusion, these results support the notion that DEFB126 is important in human sperm maturation and that the potential use of DEFB126 for in vitro sperm maturation.

Une des fonctions cruciales de l’épididyme est la mise en place du glycocalyx qui encapsule les spermatozoïdes en maturation. Le glycocalyx pourrait jouer un rôle important pour la maturation et la capacitation des gamètes mâles. Les défensines sont une famille de peptides antimicrobiens cationiques, dont certains sont exprimés dans l’épididyme. La β-défensine 126 (DEFB126) et le sperm-associated antigen (SPAG11B) sont deux β-défensine épididymaires dont les rôles dans la maturation spermatique et la capacitation ont été démontrés chez plusieurs espèces. Chez les hommes souffrant d’azoospermie, des spermatozoïdes peuvent être extraits des testicules, ils sont alors immatures et immotiles. Pour ces patients, une maturation des spermatozoïdes in vitro peut améliorer le pouvoir fécondant des gamètes, dans le cadre d’une injectio de spermatozoïdes intra-cytoplasmique.

Le premier objectif de ce projet est de comparer l’expression, la localisation et les niveaux d’ARNm de la DEFB126 et de la SPAG11B dans les canaux efférents et l’épididyme, chez des hommes fertiles et des patients atteints d’azoospermie non-obstructive (ANO). Des expériences d’immunohistochimie n’ont pas mis en évidence de différences significatives entre l’expression de la DEFB126 ni de la SPAG11B dans les canaux efférents ni le long de l’épididyme chez des patients fertiles ou souffrant d’azoospermie non-obstructive. Cependant, l’expression de SPAG11B et les niveaux d’ARNm de l’isoforme D de SPAG11B de la queue de l’épididyme des patients atteints d’azoospermie non-obstructive ont été détectés significativement plus bas que chez les hommes fertiles.

Comme second objectif, la corrélation entre la DEFB126 et la maturation spermatique chez l’Homme a été déterminée. Des expériences d’immunofluorescence, associées avec des tests de motilité spermatique (swim-up tests) ont montré que la proportion de spermatozoïdes DEFB126-positifs était remarquablement plus grande dans la population de spermatozoïdes motiles. Des expériences complémentaires, réalisées avec différents patients, indiquent que la proportion des spermatozoïdes marqué avec l’anti-DEFB126 est positivement corrélée avec le pourcentage de spermatozoïdes motiles et une morphologie normale. De plus, notre étude sur les patients fertiles, les patients souffrant de varicocèle, et les patients infertiles (avec une déficiente) montre que la proportion de spermatozoïdes DEFB126-positifs chez les patients fertiles est significativement plus grande en comparaison avec les patients atteints de varicocèles, ou infertiles.

Afin de déterminer le rôle de DEFB126 dans la mobilité des spermatozoïdes, le gène codant cette protéine a été cloné et utilisé pour générer des mutants de DEFB126 grâce à des cellules H9C2. Les mutations ont été créées par délétions nucléotidiques dans deux régions de la protéine spécifiquement liées à l’infertilité masculine. Des spermatozoïdes immobiles de testicules ont été incubés avec des cellules exprimant les différentes formes de DEFB126. La forme non mutée entraine une augmentation de 15% de la mobilité des spermatozoïdes alors qu’aucune augmentation n’est observée en présence des formes mutées de la protéine.

En conclusion, ces résultats confirment l’importance de la protéine DEFB126 dans la maturation des spermatozoïdes humains et révèlent son potentiel d’utilisation dans la maturation des spermatozoïdes in vitro.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Cyr, Daniel G.
Mots-clés libres:	Epididymis; fertility; DEFB126; SPAG11B; sperm motility; in vitro sperm maturation; NOA; Épididyme; fertilité; motilité spermatique; maturation spermatique in vitro; ANO
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	01 juill. 2024 14:01
Dernière modification:	01 juill. 2024 14:01
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15771

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