Expression d'une protéine d'attachement du canid herpesvirus 1, la glycoprotéine D, et la purification des protéines cellulaires interagissantes

Micky, Samar (2022). Expression d'une protéine d'attachement du canid herpesvirus 1, la glycoprotéine D, et la purification des protéines cellulaires interagissantes Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en en virologie et immunologie, 71 p.

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Résumé

Canid Herpesvirus 1 (CHV-1) est un Varicellovirus avec un tropisme pour les cellules épithéliales canines. Les facteurs cellulaires et viraux qui régulent l’entrée du virus ne sont pas entièrement connus. Nous avons précédemment démontré que le CHV-1 pénètre dans les cellules épithéliales non polarisées Madin-Darby canine kidney (MDCK) par un mécanisme similaire à la macropinocytose. Le virus induit la formation de protrusions membranaires lamellipodales qui se replient pour endocytoser le virus. Cependant, à ce jour le récepteur d’entrée du virus n’est pas identifié. À cet égard, notre objectif a été de purifier les protéines cellulaires qui se lient à la glycoprotéine virale D (gD), dans le but d’identifier le récepteur. Pour cela, nous avons généré un vecteur plasmidique exprimant l’ectodomaine de la gD, fusionné au domaine Fc de l’immunoglobuline humaine IgG-1. Le vecteur comprenait le signal de sécrétion de l’IL-2. Ce vecteur plasmidique a été transfecté dans des cellules HEK293T, et la glycoprotéine virale recombinante a été isolée du surnageant à l’aide des billes d’agarose de protéine A. Les protéines cellulaires ligands de la gD ont été coprécipitées, à partir d’un lysat de cellules MDCK. Les protéines purifiées ont été identifiées par spectrométrie de masse. Les protéines cellulaires identifiées ont des caractéristiques consistantes avec des récepteurs putatifs. Par ailleurs, nous avons étendu notre étude pour étudier l’entrée du CHV-1 dans les cellules MDCK polarisées. En utilisant la microscopie électronique à balayage, nous avons constaté que l’infection par CHV-1 ne modifie pas les extensions lamellipodales de la membrane sur la surface apicale des cellules MDCK polarisées. De plus, nous avons constaté que le CHV-1 infecte les cellules polarisées MDCK à la fois apicalement et basolatéralement ; cependant, l’infection du côté basolatéral a entrainé des titres viraux 759 fois plus élevés que lorsque les cellules étaient infectées du côté apical. Ces résultats suggèrent qu’il existe une distribution asymétrique des récepteurs cellulaires sur les cellules polarisées qui favorise l’entrée préférentielle du virus à partir de la surface basolatérale. La découverte du ou des récepteurs d’entrée du CHV-1 contribuera à une meilleure compréhension de la première étape de l’infection de cet agent pathogène vétérinaire. Cette connaissance pourrait être utilisée dans la conception de nouveaux thérapeutiques contre le CHV-1.

Canid Herpesvirus 1 (CHV-1) is a Varicellovirus with tropism for canine epithelial cells. The cellular and viral factors regulating virus entry are not fully known. We previously demonstrated that CHV-1 enters non-polarized Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cells by a macropinocytosis-like mechanism. The virus induces the formation of extensive lamellipodial membrane protrusions that fold back to endocytose the virus. However, to this day, the entry receptor of the virus is not identified. To address this question, we wished to purify the cellular ligand of the viral glycoprotein D (gD), to identify the receptor(s) responsible for CHV-1 entry into MDCK cells. We generated a plasmid vector expressing the ectodomain of gD fused to the Fc domain of human immunoglobulin IgG-1. The vector included the secretion signal for IL-2. This plasmid vector was transfected into HEK293T cells, and recombinant viral glycoprotein was isolated from the supernatant using protein A agarose. We affinity purified the gD ligands from MDCK cell lysates. The purified proteins were identified by mass spectrometry. Several of the proteins specifically retained by the gD-Fc affinity matrix belonged to families of membrane proteins that could be putative receptors. Moreover, we extended our study to investigate the entry of CHV-1 into polarized MDCK cells. Using scanning electron microscopy, we found that CHV-1 infection does not alter the lamellipodial membrane extensions on the apical surface of polarized MDCK cells. Moreover, we found that CHV-1 infects MDCK polarized cells both apically and basolaterally; however, infection of the basolateral side resulted in viral titers that were 759-fold higher than when the cells were infected from the apical side. These results suggest that there is an asymmetric distribution of cellular receptors on polarized cells that promotes the preferential entry of the virus from the basolateral surface. Discovering the CHV-1 entry receptor(s) will contribute to a better understanding of the first step of infection of this veterinary pathogen, knowledge that could be used in the design of new therapeutics against CHV-1.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Pearson, Angela
Mots-clés libres:	Canid herpesvirus 1 ; Ligand gD ; Cellules MDCK polarisées ; lamellipodes ; Interaction virus-cellule hôte; gD ligand; Polarized MDCK cells; lamellipodia; virus-host cell interaction
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	01 juill. 2024 14:00
Dernière modification:	01 juill. 2024 14:00
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15765

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