Caractérisation du rôle du facteur de fragmentation de l’ADN 40 dans l’acquisition d’éléments clés de la tumorigenèse

Kulbay, Merve (2022). Caractérisation du rôle du facteur de fragmentation de l’ADN 40 dans l’acquisition d’éléments clés de la tumorigenèse Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 283 p.

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Résumé

Le facteur de fragmentation de l’ADN 40 (DFF40) est l’endonucléase régissant l’étape ultime de l’apoptose et est nécessaire au maintien de l’homéostasie cellulaire et tissulaire. Des altérations dans son expression ont été démontrée dans de multiples tumeurs et associées avec un mauvais pronostic. De nombreuses études ont suggéré un rôle du DFF40 dans la stabilité génomique et dans le développement de la tumorigenèse. Dans ce projet de thèse, nous avons généré une lignée cellulaire stable déficiente en l’expression du DFF40 (DFF40 KO) par CRISPR-cas9, en utilisant les cellules T Jurkat comme modèle d’étude. Nous avons par la suite caractérisé la réponse cellulaire des cellules DFF40 KO à divers agents inducteurs d’apoptose et étudié les mécanismes moléculaires impliqués. Premièrement, nous avons démontré que les cellules déficientes en DFF40 ont une augmentation de l’expression basale de Mcl-1. Deuxièmement, une déficience en DFF40 altère le métabolisme énergétique basal. Les cellules DFF40 KO ont une augmentation de la production de ROS, une modification du potentiel de membrane mitochondriale, une augmentation de la quantité d’ADN mitochondriale et une production d’énergie dépendante de la glycolyse. L’exposition à des agents inducteurs d’apoptose a démontré que les cellules Jurkat DFF40 KO sont résistantes à la mort cellulaire induite par le tributylétain (TBT), la staurosporine (STS) et les antimétabolites, dont le méthotrexate (MTX), 6-mercaptopurine (6-MP) et cytarabine (Ara-C). De manière intéressante, les cellules déficientes en DFF40 ont une plus grande sensibilité aux inhibiteurs de la topoisomérase II (TOP2), dont l’etoposide (ETO). Nous avons démontré que la résistance au TBT est due à un retard d’activation de l’apoptose, caractérisé par un retard de clivage de la procaspase-3 et PARP, ainsi qu’un retard d’activation de la caspase-6. De plus, les cellules DFF40 KO ont une augmentation de la phosphorylation de Bcl-2 suivant l’induction de l’apoptose au TBT. L’abolition de l’expression du DFF40 altère les mécanismes de réparation de l’ADN. Les cellules DFF40 KO ont une absence de phosphorylation de l’histone H2AX. L’analyse de l’activation des voies de réparation de l’ADN démontre une phosphorylation accrue de CHK1 et une diminution significative de la phosphorylation de CHK2. Nos résultats supportent l’hypothèse que le DFF40 est impliqué dans l’instabilité génomique au sein des cellules cancéreuses et dans la résistance aux agents de chimiothérapie.

The DNA fragmentation factor (DFF40) is the endonuclease governing the final step of apoptosis and is necessary for the maintenance of cellular and tissue homeostasis. Alterations in its expression have been demonstrated in multiple tumors and associated with poor prognosis. Numerous studies have suggested a role of DFF40 in genomic stability and in the development of tumorigenesis. In this thesis project, we generated a stable cell line deficient in DFF40 expression (DFF40 KO) by CRISPR-cas9, using Jurkat T cells as a study model. We then characterized the cellular response of DFF40 KO cells to various apoptosis-inducing agents and studied the molecular mechanisms involved. First, we demonstrated that DFF40-deficient cells have increased Mcl-1 expression at a basal state and impaired energy metabolism. DFF40 KO cells have increased ROS production, altered mitochondrial membrane potential, increased amount of mitochondrial DNA, and a glycolysis-dependent energy production in non-apoptotic conditions. Exposure to apoptosis-inducing agents demonstrated that Jurkat DFF40 KO cells are resistant to cell death induced by tributyltin (TBT), staurosporine (STS), and antimetabolites, namely methotrexate (MTX), 6-mercaptopurine (6-MP) and cytarabine (Ara-C). Interestingly, cells deficient in DFF40 have a greater sensitivity to topoisomerase II (TOP2) inhibitors, such as etoposide (ETO). We demonstrated that resistance to TBT is due to delayed activation of apoptosis, characterized by delayed cleavage of procaspase-3 and PARP, as well as delayed activation of caspase-6. In addition, DFF40 KO cells have increased Bcl-2 phosphorylation following TBT induction of apoptosis. Abolition of DFF40 expression alters DNA repair mechanisms. DFF40 KO cells have an absence of histone H2AX phosphorylation. Analysis of the activation of DNA repair pathways demonstrates an increased phosphorylation of CHK1 (i.e. activation of ATR) and a significant decrease in phosphorylation of CHK2 (i.e. inhibition ATM). Our results support the hypothesis that DFF40 is involved in genomic instability within cancer cells and in resistance to chemotherapy agents.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Bernier, Jacques
Mots-clés libres:	Apoptose; résistance; DFF40; instabilité génomique; métabolisme énergétique; voies de réparation de l’ADN; Apoptosis; genomic instability; cell metabolism; DNA repair pathways
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	01 juill. 2024 14:01
Dernière modification:	01 juill. 2024 14:01
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15764

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