Investigating the role of C9orf72 in amyotrophic lateral sclerosis using a zebrafish model

Butti, Zoe (2022). Investigating the role of C9orf72 in amyotrophic lateral sclerosis using a zebrafish model Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 236 p.

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Résumé

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs causant une atrophie musculaire, une paralysie progressive et la mort des patients. À ce jour, il n’existe encore aucun traitement curatif pour la maladie. C’est pourquoi comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie aidera à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. En 2011, une expansion d’hexanucléotide (GGGGCC) dans la première région intronique du gène C9orf72 a été découverte comme la cause génétique la plus fréquente de SLA. Cette expansion de répétitions d’hexanucléotide mène à trois mécanismes : deux gains de fonctions toxiques avec une production d’ARN qui vont s’agréger dans les noyaux cellulaires ainsi qu’avec la traduction de ces ARN qui amène à une agrégation de dipeptides dans les cytoplasmes. Le troisième mécanisme est le moins étudié et est un mécanisme de perte de fonction menant à une haploinsuffisance du gène C9orf72. Cette perte d’expression tant au niveau de l’ARN que protéique a été rapporté dans des tissus post-mortem de patients. Pour étudier la perte de fonction de ce gène dans la maladie, nous avons utilisé des microARN synthétiques afin de réduire spécifiquement l’expression du gène C9orf72 chez le poisson zèbre (C9-miARN). Nous avons développé une lignée stable de poisson zèbre C9-miRNA chez laquelle l’expression de C9orf72 est réduite. En conséquence de la perte de fonction de C9orf72, nous avons observé que notre lignée mutante présentait des déficits moteurs sévères à partir de 6 jours post-fertilisation (jpf) et que la majorité des poissons zèbres mouraient prématurément à 15 jpf. Une analyse de la jonction neuromusculaire (JNM) à l’aide de marqueurs pré- et post-synaptiques spécifiques, SV2 et l’alpha-bungarotoxine respectivement, a montré une diminution significative du nombre de JNM chez les C9-miARN à 6 jpf, ce qui corrèle avec une diminution du renouvellement des vésicules synaptiques. La diminution d’expression de SV2a a été confirmé lors d’une analyse en spectrométrie de masse et nous avons également montré une interaction entre C9orf72 et SV2a à l’aide de co-immunoprécipitation, ce qui suggère un fort lien de régulation entre C9orf72 et SV2a. Des enregistrements électrophysiologiques à l’aide de la technique de patch clamp sur des fibres musculaires ont montré une diminution de l’amplitude et de la fréquence des courants de plaques miniatures, ce qui suggère une diminution du nombre de boutons pré-synaptiques. Aussi, nous avons trouvé des agrégats protéiques de TDP-43 chez nos mutants C9-miARN. Parmi les poissons qui ont survécu jusqu’à l’âge adulte, nous avons observé une atrophie sévère des neurones moteurs ainsi que de la moelle épinière. Notre analyse de spectrométrie de masse a également montré une diminution de l’expression de la calpastatine dans notre lignée mutante, une protéine neuroprotectrice. Nous avons donc pharmacologiquement compensé cette perte d’expression de la calpastatine et observé un sauvetage phénotypique partiel du nombre de JNM ainsi que du renouvellement des vésicules synaptiques, ce qui indique que cette voie pourrait être dérégulée et mener à la dysfonction synaptique observée. Ensemble, ces résultats montrent que notre lignée C9-miARN représente un bon modèle de la SLA, démontrent un rôle de C9orf72 pour la transmission synaptique à la JNM et enfin, notre modèle ouvre la voie pour étudier l’effet neuroprotecteur de la calpastatine en tant que potentiel traitement thérapeutique.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease that affects motoneurons causing muscular atrophy, paralysis and ultimately death. Presently, no curative treatment exists. Understanding the physiopathological mechanisms can help identify new therapeutic targets. In 2011, an expansion of a repetition of a hexanucleotide (GGGGCC) in the first intronic region of the C9orf72 gene has been discovered as the first genetic cause of ALS. This expansion of hexanucleotide repetition leads to three pathological mechanisms: two toxic gain of function with the production of RNA aggregating mainly in the cell nucleus and with the translation of these RNAs leading to dipeptide repeats aggregating in the cell cytoplasm. The third mechanism is the less studied and is a loss of function of the gene C9orf72 leading to its haploinsufficiency. This loss of expression both at the RNA and protein levels has been reported from post-mortem patient tissue. To investigate the role of C9orf72 loss of function in ALS, we used four synthetic micro-RNAs to specifically target the zebrafish C9orf72 gene (C9-miRNA) and have developed a stable zebrafish C9-miRNA line with reduced expression of C9orf72. Upon loss of function of C9orf72, we observed that zebrafish C9-miRNA mutants display severe motor deficits beginning 6 days postfertilization (6 dpf) and a majority die prematurely at 15 dpf. Analysis of the neuromuscular junctions using specific presynaptic and postsynaptic markers SV2a and alpha-bungarotoxin respectively, revealed a significant decrease in the number of synaptic contacts in the C9-miRNA line at 6 dpf correlating with a decreased synaptic vesicles turnover. SV2a loss of expression was confirmed in a mass spectrometry analysis that showed a great reduction of SV2a protein level, and we showed that C9orf72 interacts with SV2a using Co-IP technique strongly suggesting a regulation between C9orf72 and SV2a. Electrophysiology recordings using patch clamp technique on muscle fibres showed a decrease of amplitude and frequency of the spontaneous miniature end plate currents, which suggests a decreased number of presynaptic endings. Also, TDP-43 has been shown to aggregates starting 6 dpf in our C9-miRNA. Among the few fish that survived until adulthood, we observed a significant motoneuron and muscle atrophy. Mass spectrometry also showed a decreased expression of the neuroprotective protein, calpastatin in our mutant. Thus, we pharmacologically compensated the loss of calpastatin and observed some rescue of the number of synaptic contacts and vesicle turnover indicating that this pathway may have a role in the synaptic dysfunction. Altogether, our zebrafish C9-miRNA replicates aspects of ALS and showed that C9orf72 has a role in the synaptic transmission at the NMJ, last, the model brought new avenue to study neuroprotection by working on the calpastatin pathway.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Patten, Shunmoogum A.
Mots-clés libres:	Sclérose latérale amyotrophique; maladie neurodégénérative; poisson zèbre; C9orf72; neurone moteur; jonction neuromusculaire; calpastatine; Amyotrophic lateral sclerosis; neurodegenerative disease; zebrafish; motoneuron; neuromuscular junction; calpastatin
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	01 juill. 2024 14:07
Dernière modification:	01 juill. 2024 14:07
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15757

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