Ingénierie des ribozymes pour développer un circuit logique applicable comme nouvel outil de diagnostic et thérapie

Najeh, Sabrine (2022). Ingénierie des ribozymes pour développer un circuit logique applicable comme nouvel outil de diagnostic et thérapie Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 290 p.

Prévisualisation	PDF - Version acceptée Télécharger (8MB) | Prévisualisation
	Microsoft Excel - Matériel supplémentaire Télécharger (42kB)

Résumé

La découverte du pouvoir catalyseur des ARN a entraîné un changement du dogme de la biologie. Les protéines ne constituaient plus les seules entités responsables des activités enzymatiques dans les cellules. De multiples études ont contribué à l’identification des fonctions ainsi qu’à la compréhension des structures de ces enzymes à ARN. Ces ribozymes se sont avérés impliqués dans de multiples processus biologiques, allant de la réplication virale jusqu’à la synthèse protéique chez les eucaryotes et les procaryotes. Ceux impliqués dans la réplication virale sont responsables de la libération de la nouvelle copie de génome par l’auto-clivage de cette dernière. Les ribozymes ayant cette activité appartiennent à la famille des petits ARN auto-clivants. Les ARN de cette famille ont attiré beaucoup d’attention en raison des différentes façons dont ils peuvent être employés dans la régulation de l’expression génique. Ceci a été fait par l’ingénierie des séquences de ces ribozymes avec des méthodes manuelles et des sélections in vitro. Le tout a été possible grâce à de nombreuses recherches ayant permis la détermination des structures des ribozymes auto-clivants, aboutissant à une meilleure compréhension des motifs structuraux de l’ARN en général. Ainsi, l’ingénierie de ces ribozymes et d’autres ARN a été préconisée pour leur application dans des thérapies géniques contre des gènes viraux et des gènes impliqués dans le cancer. Les essais de ces ribozymes ont atteint des phases cliniques ; ils ont par contre échoué. De ce fait, lorsque l’on prend en considération les motifs structuraux ainsi que l’environnement de l’application, l’optimisation de l’ingénierie des ribozymes pourrait aider à surmonter de tels échecs. Dans cette optique, plusieurs outils bioinformatiques ont été développés pour la génération automatisée des ARN synthétiques ayant des structures et des fonctions prédéfinies.

Dans le cadre de mon projet, nous nous sommes intéressés aux ribozymes en tant que potentiels outils thérapeutiques et diagnostiques. Notre hypothèse est qu'en combinant des ribozymes thérapeutiques avec des biosenseurs, nous pourrions développer un circuit logique applicable comme thérapie intelligente. Cette thérapie permet en parallèle de détecter des molécules indiquant ou non la présence d’un cancer et dépendamment de ces signaux de prendre la décision de tuer la cellule ou non. Au cours de la première étape du projet, nous nous sommes penchés sur deux nouveaux programmes de conception de ribozymes. Le premier, qui est nommé « Enzymer », est destiné à la conception de ribozymes auto-clivants ayant des pseudonoeuds, un motif de structure secondaire indispensable à l’activité de plusieurs ARN. Nous avons utilisé ce programme pour la génération de deux types de ribozymes dans le but de prouver l’efficacité de cet outil ainsi que le développement d’un « switch OFF » pour contrôler l’expression d’une protéine fluorescente chez les bactéries. Le deuxième outil était le service web « Ribosoft 2.0 », destiné à la conception de différents types de ribozymes actifs en trans. Nous avons eu recours à ce logiciel dans le contexte de choix de ribozymes efficaces pour cibler des ARNm de protéines impliquées dans le cancer. En plus de l’utilisation de ces outils pour nos objectifs de recherche, nous avons participé à leur optimisation à l’aide de nos résultats expérimentaux.

En deuxième lieu, nous avons profité de la flexibilité des ribozymes pour développer des biosenseurs détectant des protéines et des miARN qui peuvent être appliqués comme outils de diagnostics. Les ribozymes liant les miARN ont également été conçus en utilisant des méthodes computationnelles. Quant aux ribozymes détectant les protéines, une sélection in vitro a été appliquée ; ce qui a mené à la génération d’aptazymes, qui sont la combinaison d’un aptamère et d’un ribozyme. Ces aptazymes ont été combinés avec un aptamère et des billes fluorescentes, produisant ainsi des biosenseurs détectant des protéines qui peuvent être utilisées comme biomarqueurs de certains types de cancers.

The discovery of the catalytic power of RNAs led to a change in the dogma of biology. Proteins were no longer the only entities responsible for enzymatic activities in cells. Multiple studies have contributed to the identification of the functions and the understanding of the structures of the RNA enzymes. The ribozymes have been shown to be involved in multiple biological processes, ranging from viral replication to protein synthesis in eukaryotes and prokaryotes. Those involved in viral replication are responsible for releasing of the new genome copy by the self-cleavage of the latter. Ribozymes with this activity belong to the family of self-cleaving small RNAs. RNAs from this family have attracted a lot of attention because of the different ways they can be employed to regulate gene expression. This was done by engineering the sequences of these ribozymes with manual methods and in vitro selections. All this has been possible thanks to numerous researches that have allowed the determination of the structures of self-cleaving ribozymes, leading to a better understanding of the structural motifs of RNA in general. Thus, the engineering of these ribozymes and other RNAs has been advocated for their application in gene therapies against viral genes and genes involved in cancer. Trials of these ribozymes have reached clinical phases; however, they failed. Therefore, when considering the structural motifs as well as the application environment, optimizing ribozyme engineering could help overcome such failures. In this perspective, several bioinformatics tools have been developed for the automated generation of synthetic RNAs with predefined structures and functions.

As part of my project, we were interested in ribozymes as potential therapeutic and diagnostic tools. Our hypothesis is that by combining therapeutic ribozymes with biosensors, we could develop a logic circuit applicable as an intelligent therapy. This therapy makes it possible, in parallel, to detect molecules indicating or not the presence of cancer and, depending on these signals, to make the decision to kill the cell or not. During the first stage of the project, we looked at two new ribozyme design programs. The first, which is called "Enzymer", is intended for the design of self-cleaving ribozymes with pseudoknots, a secondary structure motif essential for the activity of several RNAs. We used this program for the generation of two types of ribozymes in order to prove the effectiveness of this tool as well as the development of an "OFF switch" to control the expression of a fluorescent protein in bacteria. The second tool was the "Ribosoft 2.0" web service, intended for the design of different types of trans-active ribozymes. We used this software in the context of choosing effective ribozymes to target mRNAs of proteins involved in cancer. In addition to the use of these tools for our research objectives, we participated in their optimization using our experimental results.

During the second aim of my project, we have taken advantage of the modularity of ribozymes to develop biosensors detecting proteins and miRNAs that can be applied as diagnostic tools. The miRNA-binding ribozymes were also designed using computational methods. As for the ribozymes detecting the proteins, an in vitro selection strategy was used to generate aptazymes, which are the combination of an aptamer and a ribozyme. These aptazymes were combined with an aptamer and fluorescent beads, allowing to produce biosensors detecting proteins that can be used as biomarkers of certain types of cancer.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Perreault, Jonathan
Co-directeurs de mémoire/thèse:	St-Pierre, Yves
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	02 juill. 2024 13:53
Dernière modification:	02 juill. 2024 13:53
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15741

Gestion Actions (Identification requise)

Modifier la notice