Dynamique de la dénitrification en milieux salins des espèces Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 et Hyphomicrobium nitrativorans NL23

Cucaita Vasquez, Alexandra (2021). Dynamique de la dénitrification en milieux salins des espèces Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 et Hyphomicrobium nitrativorans NL23 Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 173 p.

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Résumé

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La production excessive de polluants dans les milieux marins dérivés de la croissance des organismes aquatiques peut interférer avec l'équilibre des écosystèmes. Le nitrate est un problème sérieux dans les systèmes en circuit fermé (l’eau est continuellement recyclée) comme les aquariums, car il s'accumule rapidement en devenant toxique pour certains organismes. La dénitrification biologique est de plus en plus utilisée pour traiter et éliminer le nitrate des eaux usées constituant une alternative efficace et économique. Deux souches bactériennes ont été isolées d’un biofilm issu d’un réacteur de dénitrification à lit fluidisé alimenté au méthanol pour contrôler la concentration de nitrate dans le grand aquarium d’eau marine du Biodôme de Montréal. Ces deux souches sont responsables de l’activité dénitrifiante dans le biofilm. La première souche, Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1, est capable de croître en culture pure dans des conditions anoxiques, en réduisant le NO3- en nitrite; Elle ne peut réduire le NO2- en NO. Toutefois, elle peut réduire le NO en N2O, et le N2O en N2. La deuxième souche, Hyphomicrobium nitrativorans NL23, est capable de dénitrification complète, à partir du NO3- jusqu’au N2.

Nous avons émis l'hypothèse qu'une complémentarité entre les deux espèces existerait dans le biofilm pour assurer une bonne activité dénitrifiante. Le but du projet a été d'évaluer le degré de cette complémentarité en utilisant une approche de co-cultures. Il a été nécessaire de caractériser la dynamique de l'interaction entre ces deux espèces dans le milieu marin pour établir l'impact et l'apport de chacune à l'intérieur du processus. Très peu d'études ont été faites impliquant des co-cultures de souches bactériennes dénitrifiantes et encore moins en milieu marin. Les résultats obtenus dans ce projet permettront d’améliorer l'efficacité du processus de dénitrification et leur soutenabilité lorsqu'ils seront appliqués à plus grande échelle, ce qui pourra nous amener au développement d'un bioprocédé de dénitrification en milieu marin plus efficace.

Avec les connaissances acquises sur les deux souches à travers plusieurs études dans notre laboratoire et avec une série de tests visant à établir les caractéristiques physiologiques et de synergie entre les souches, il a été possible d'établir que la souche JAM1 possède un avantage sur la souche NL23 en ce qui concerne l'assimilation du substrat lorsqu'il est utilisé en co-cultures. La souche JAM1 est capable de réduire le nitrate présent dans le milieu de culture dans un temps plus court que celui observé pour la souche NL23, du fait qu'elle a une affinité plus élevée du nitrate. Cependant, une stimulation préalable de la voie de dénitrification de la souche NL23 a permis à celle-ci de réduire le temps d'assimilation du substrat et ainsi d'améliorer ses performances pour être plus compétente en co-cultures par rapport à la souche JAM1.

Les tests d'antagonisme réalisés avec les souches ont montré qu'il n'y a aucun type d'interaction négative entre les souches qui puisse affecter la croissance de l'une d'entre elles lorsqu'elles sont en co-cultures, tout comme aucun type de molécule de communication (quorum sensing) n'est produit qui interfèrerait avec la densité de certaines des souches lors du développement de biofilm.

Le suivi des co-cultures a été réalisé aussi bien à l'état planctonique qu'à l'état Biofilm, à travers différentes concentrations de NaCl. À l'état planctonique, la souche NL23 a présenté un taux de dénitrification plus faible lorsqu'elle est trouvée en culture pure par rapport à ce qui a été observé en co-cultures. De plus, la faible capacité de la souche NL23 à croître à des concentrations élevées de NaCl, lorsqu'elle est en suspension a été mise en évidence. Le développement et le suivi d'un biofilm dans un réacteur a donné à la souche NL23 la possibilité de s'acclimater à un milieu marin. La capacité des deux souches à adhérer aux supports a permis la formation d'un biofilm performant, avec une activité dénitrifiante permanente, dans lequel la souche NL23 était toujours active et présente. La souche JAM1 a toujours été trouvée dans une proportion plus élevée à travers les différentes concentrations de NaCl évaluées. Il a été déterminé que la souche JAM1 était capable de produire le soluté compatible appelé de l'ectoïne. Ces solutés compatibles, en plus de maintenir l'équilibre osmotique causée par une concentration élevée de sels ou d'autres solutés non ioniques dans le milieu extracellulaire, ont des propriétés biostabilisantes. (Pastor J. et al., 2010). L'importance dans cette étude s'est concentrée sur la démonstration que la souche JAM1 est capable de produire d'ectoïne dans le milieu de culture, permettant une meilleure adaptation de la souche NL23 aux changements brusques de concentration en NaCl dans la co-culture. En plus d'établir que la concentration de cette molécule dans le milieu de culture était proportionnelle à l'augmentation de la concentration en sel. La concentration d'ectoïne dans le biofilm du réacteur (co-culture) était plus élevée à des concentrations élevées de NaCl. La présence de cette molécule dans la co-culture biofilm est un facteur important qui expliquerait pourquoi la souche NL23 a été mieux adaptée aux changements de concentration de NaCl dans le biofilm.

Ces résultats illustrent la capacité des souches NL23 et JAM1 pour effectuer une dénitrification performante en milieu marin. Bien que la souche JAM1 n'ait pas contribué à de meilleures activités dénitrifiantes spécifiques dans les réacteurs, sa présence était essentielle à la survie de la souche NL23 dans un milieu avec des concentrations supérieures à 1,0% de NaCl.

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The excessive production of pollutants in marine environments derived from the growth of aquatic organisms can interfere with the balance of ecosystems. Nitrate is a serious problem in closed loop systems (water is continuously recycled) such as aquariums because it accumulates quickly and becomes toxic to some organisms. Biological denitrification is increasingly used to treat and remove nitrate from wastewater as an efficient and economical alternative. Two bacterial strains were isolated from a biofilm from a methanol-fueled fluidized bed denitrification reactor to control the nitrate concentration in the large marine aquarium at the Biodôme de Montréal. These two strains are responsible for the denitrifying activity in the biofilm. The first strain, Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1, is able to grow in pure culture under anoxic conditions, reducing NO3- to nitrite; It cannot reduce NO2- to NO. However, it can reduce NO to N2O, and N2O to N2. The second strain, Hyphomicrobium nitrativorans NL23, is capable of complete denitrification, from NO3- to N2.

We hypothesized that a collaboration between the two species must exist in the biofilm to establish a good denitrifying activity. The aim of the project was to assess the degree of this collaboration using a co-culture approach. It was necessary to characterize the dynamics of the interaction between these two species in the marine environment to establish the impact and contribution of each within the process. Very few studies have been done involving co-cultures of denitrifying bacterial strains and even fewer in the marine environment. The results obtained in this project will improve the efficiency of the denitrification process and its sustainability when applied on a larger scale, which may lead to the development of a more efficient marine denitrification bioprocess.

With the knowledge acquired on the two strains through several studies in the laboratory of Professor Richard Villemur and with a series of tests aimed at establishing the physiological and synergistic characteristics between the strains, it was possible to establish that the JAM1 strain possesses an advantage over strain NL23 with regard to the assimilation of the substrate when it is found in co-cultures. The JAM1 strain is capable of reducing the nitrate present in the culture medium in a shorter time than that observed for the NL23 strain, due to the fact that it has a higher affinity for nitrate. However, prior stimulation of the denitrification pathway of strain NL23 enabled it to reduce the assimilation time of the substrate and thus improve its performance in order to be more competitive in co-cultures compared to the JAM1 strain.

The antagonism tests carried out with the strains have shown that there is no type of negative interaction between the strains that can affect the growth of one of them when they are in co-cultures, just as no type of communication molecule (quorum sensing) is produced which would interfere with the density of some of the strains during the development of biofilm.

The monitoring of the co-cultures was carried out both in the planktonic state and in the Biofilm state, through different concentrations of NaCl. In the planktonic state, strain NL23 exhibited a lower denitrification rate when it is found in pure culture compared to what was observed in co-cultures. In addition, the low capacity of strain NL23 to grow at high concentrations of NaCl, when it is in suspension has been demonstrated. The development and monitoring of a biofilm in a reactor gave strain NL23 the ability to acclimatize to a marine environment. The ability of the two strains to adhere to the supports allowed the formation of an efficient biofilm, with a permanent denitrifying activity, in which the strain NL23 was still active and present. The JAM1 strain was always found in a higher proportion across the different NaCl concentrations evaluated. It was determined that the JAM1 strain was able to produce the compatible solute called ectoin. These compatible solutes, in addition to maintaining the osmotic balance caused by a high concentration of salts or other non-ionic solutes in the extracellular environment, they have biostabilizing properties. (Pastor J. et al., 2010). The importance in this study focused on the demonstration that the JAM1 strain is able to produce ectoin in the culture medium, allowing a better adaptation of the NL23 strain to sudden changes in NaCl concentration in the co-culture. In addition to establishing that the concentration of this molecule in the culture medium was proportional to the increase in salt concentration. The concentration of ectoin in the reactor biofilm (co-culture) was higher at high concentrations of NaCl. The presence of this molecule in the biofilm co-culture is an important factor that would explain why strain NL23 was better adapted to changes in NaCl concentration in the biofilm.

These results illustrate the ability of strains NL23 and JAM1 to perform efficient denitrification in a marine environment. Although the JAM1 strain did not contribute to better specific denitrifying activities in the reactors, its presence was essential for the survival of the NL23 strain in a medium with concentrations above 1.0% NaCl.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Villemur, Richard
Mots-clés libres:	Biofilm; Hyphomicrobium nitrativorans NL23; Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1; denitrifying activity; co-culture; activité dénitrifiante
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	02 juill. 2024 13:51
Dernière modification:	02 juill. 2024 13:51
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15736

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