Identification du mécanisme d’entrée du Canid herpesvirus 1 dans les cellules épithéliales Madin-Darby Canine Kidney

Eisa, Mohamed (2021). Identification du mécanisme d’entrée du Canid herpesvirus 1 dans les cellules épithéliales Madin-Darby Canine Kidney Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en en immunologie et virologie, 137 p.

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Résumé

IDENTIFICATION DU MECANISME D’ENTREE DU CANID HERPESVIRUS 1 DANS LES CELLULES EPITHELIALES MADIN-DARBY CANINE KIDNEY

L’herpesvirus canin (CHV-1 pour Canid herpesvirus 1) est un varicellovirus qui est répandu chez les membres de la famille des canidés, infectant principalement les chiens. CHV-1 cause chez les chiots nouveau-nés des morbidités et de la mortalité, ainsi que chez les chiens adultes des maladies respiratoires, génitales et oculaires. En tant que parasite intracellulaire obligatoire, les virus doivent pénétrer dans les cellules hôtes pour établir une infection efficace et assurer leur propagation à un nouvel hôte. L'entrée virale représente une première étape essentielle dans le cycle de réplication virale. La voie d'entrée du CHV-1 dans les cellules épithéliales de l'hôte - le site primaire pour le réplication virale – est inconnue.

Nous avons étudié la voie d'entrée du CHV-1 dans les cellules épithéliales canines du rein Madin-Darby canine kidney (MDCK). En utilisant la microscopie électronique à transmission, nous avons détecté l'entrée du CHV-1 dans des grandes vacuoles non revêtues ainsi que l'association du virus avec des protrusions membranaires. Sur la base de ces observations, nous avons formulé l'hypothèse que l'entrée du CHV-1 peut être médiée par une voie endocytaire appelée macropinocytose, une voie utilisée par les cellules pour l'absorption de relativement grands volumes de fluides extracellulaires riches en nutriments.

Pour tester le rôle possible de la macropinocytose dans l'entrée du CHV-1, nous avons étudié l'impact du blocage de certains facteurs cellulaires importants pour la macropinocytose, sur la formation de plages de lyse virales. Nos résultats ont montré que l'entrée du CHV-1 était bloquée par les inhibiteurs ciblant les échangeurs Na+/ H+, la F-actine, la myosine, p21-activated kinase, la phosphatidylinositol-3-kinase, la dynamine et la focale adhésion kinase. Ces résultats indiquent que CHV-1 utilise la machinerie de la macropinocytose durant l'entrée. De plus, les résultats avec les inhibiteurs montrent que la signalisation via les intégrines et les récepteurs de type tyrosine kinase EGFR et PDGFR sont nécessaires pour le processus d'entrée. En plus, nos résultats ont montré que l'entrée du CHV-1 dans les cellules MDCK est indépendante de l'endocytose médiée par la clathrine et par la cavéoline, des microtubules et de l'acidification endosomale.

L'une des principales caractéristiques de l'entrée virale par macropinocytose est l'induction du protrusions membranaires et l'augmentation de l'absorption des fluides. En utilisant un microscope électronique à balayage, nous avons constaté que CHV-1 induisent des protrusions de type lamellipodes. De plus, par microscopie confocale nous avons montré que le CHV-1 marqué à la fluorescence se colocalise avec un marqueur d'absorption des fluides (le dextran fluorescent). Cependant, nos résultats d'analyse par cytométrix en flux n'ont pas révélé une augmentation de l'absorption de liquide durant la première heure de l'infection par le virus. Ces résultats suggèrent que l'entrée du CHV-1 dépend d’un mécanisme lié à la macropinocytose mais non de la macropinocytose classique.

En conclusion, ces résultats décrivent pour la première fois le mécanisme d'entrée du CHV-1 dans les cellules épithéliales canines. Nos résultats ont identifié plusieurs facteurs cellulaires importants pour l'entrée du CHV-1, qui pourraient être des cibles potentielles pour le développement de futurs antiviraux contre cet important agent pathogène vétérinaire.

Canid herpesvirus (CHV-1) is a varicellovirus that is widespread in members of the Canidae family, infecting mainly dogs and causing morbidities and mortality in newborn pups as well as respiratory, genital, and ocular diseases in adult dogs. As obligate intracellular parasites, viruses have to enter host cells to establish a successful infection and ensure their replication in a new host. Viral entry represents an essential first step in the viral replication cycle. The pathway by which CHV-1 enters host epithelial cells – the initial site of viral replication – has not been identified.

We studied the entry pathway of CHV-1 into Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cells. Using transmission electron microscopy, we detected uptake of CHV-1 in large uncoated vacuoles, as well as the association of the virus with membrane protrusions. Based on these observations, we hypothesized that CHV-1 entry may be mediated by an endocytic pathway called macropinocytosis, a pathway that is used by the cells for the uptake of a relatively large volume of nutrient rich extracellular fluids.

To investigate the possible role of macropinocytosis in CHV-1 entry, we studied the impact of blocking key cellular factors for macropinocytosis on CHV-1 infection (plaque formation). Our results revealed that the entry of CHV-1 was blocked by inhibitors targeting Na+/H+ exchangers, F-actin, myosin light-chain kinase, protein kinase C, p21-activated kinase, phosphatidylinositol-3-kinase, dynamin, and focal adhesion kinase. These findings support the notion that CHV-1 hijacks macropinocytosis for its entry. Moreover, our inhibitor study also suggested that signaling via integrins and the receptor tyrosin kinases EGFR and PDGFR is required for the entry process. We found that the entry of CHV-1 in MDCK cells was independent of clathrin- and caveolin-mediated endocytosis, microtubules, and endosomal acidification.

One of the main characteristics of viral entry via macropinocytosis is the induction of cell-wide membrane ruffling and an increase in the uptake of fluids. Using scanning electron microscopy, we found that CHV-1 triggered extensive lamellipodial ruffles. Furthermore, the results from confocal microscopy showed that fluorescently-labeled CHV-1 colocalized with a marker of fluid uptake, fluorescent dextran. Nevertheless, using multiparametric FACS® analysis, we did not detect an increase in fluid uptake during the first hour of CHV-1 infection. These results suggest that CHV-1 entry depends on macropinocytosis-related mechanism, that deviates from classic macropinocytosis.

Taken together, these results describe for the first time the entry mechanism of CHV-1 into canine epithelial cells. Our results identified multiple cellular factors that are critical for CHV-1 cell entry, and thus could be a target for the design of future antivirals against this important veterinary pathogen.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Pearson, Angela
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	01 juill. 2024 13:54
Dernière modification:	01 juill. 2024 13:54
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15704

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