Développement d'agonistes stables du récepteur PAC1 : étude des relations structure-activité du Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide

Bourgault, Steve (2009). Développement d'agonistes stables du récepteur PAC1 : étude des relations structure-activité du Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 178 p.

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Résumé

Le PACAP (pituitary adenylate cyc/ase-activating polypeptide) est un neuropeptide initialement isolé pour sa capacité à stimuler la formation d'AMPc dans des cellules antéhypophysaires en culture. Jusqu'à présent, trois types de récepteurs du PACAP ont été caractérisés, nommés respectivement VPACl, VPAC2 et PACl. La large distribution du PACAP et de ses récepteurs suggère que ce système pourrait être impliqué dans la régulation de nombreux effets physiologiques. À cet égard, le PACAP, que l'on retrouve sous deux isoformes biologiquement actives de 38 et 27 résidus respectivement, agit tant au niveau du système nerveux central qu'au niveau des systèmes cardio­ vasculaire, respiratoire, digestif, endocrinien, reproducteur et immunitaire. Parmi ses nombreux effets, le PACAP favorise la survie neuronale dans divers modèles in vitro et in vivo d'atteintes neurologiques. Les propriétés neuroprotectrices du PACAP reposent principalement sur son activité anti-apoptotique régulée par l'activation du récepteur PAC1. À cet égard, le récepteur PAC1 est actuellement considéré comme une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de maladies neurodégénératives. En revanche, de par sa nature moléculaire peptidique, le ligand endogène du récepteur PACl présente des paramètres pharmacocinétiques qui limitent son utilisation comme composé médicinal cliniquement efficace. Dans 1'optique de valider le potentiel thérapeutique du PACAP, il importe donc de développer de puissants agonistes du récepteur PACl affichant une stabilité métabolique accrue. Afin de conférer au PACAP une résistance face à la protéolyse, une librairie d'analogues comportant des modifications chimiques ciblant les principaux sites potentiels de clivage enzymatique a été initialement développée. Ces dérivés ont été testés pour leur résistance face à la dipeptidyl-peptidase IV, enzyme clé du métabolisme du PACAP, pour leur stabilité plasmatique et pour leur capacité à lier et à activer le récepteur PACl. De cette librairie, un analogue du PACAP38 s'est avéré plus puissant que le peptide natif et a présenté une stabilité métabolique améliorée. L'évaluation de son activité neuroprotectrice dans un modèle d'ischémie cérébrale chez le rat a montré que ce composé réduit significativement les atteintes neurologiques et favorise la reprise des comportements moteurs. Afin d'acquérir des informations pouvant soutenir la conception rationnelle de peptides de petite taille ou même d'agonistes non-peptidiques sélectifs du récepteur PAC l, une étude de relations structure-activité a été entreprise. Au moyen de délétions ciblées et d'études structurales par dichroïsme circulaire, nous avons démontré que de nombreux domaines du PACAP27 sont cruciaux pour le maintien de l'activité biologique et que la conformation hélicoïdale du peptide n'est pas une composante suffisante pour la liaison du PACAP au récepteur PAC l . Par cette approche nous avons néanmoins identifié un analogue tronqué du PACAP27 agissant comme un agoniste complet du récepteur PACl, bien que celui-ci présente une structure secondaire aléatoire. Nous avons également caractérisé les déterminants moléculaires et structuraux de la région N­ terminale du PACAP, segment responsable de l'activation du récepteur PACl. Cette étude a conduit à l'identification de pharmacophores du récepteur PACI. De même, par l 'application de contraintes conformationnelles supportée par la modélisation moléculaire sous contraintes des données de spectroscopie RMN, un modèle de la conformation bioactive du PACAP a été proposé. Les résultats de cette étude s'inscrivent dans une démarche globale visant une meilleure compréhension du mécanisme d'action du PACAP à l'échelle moléculaire.

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) was initially isolated from ovine hypothalamic extracts on the basis of its ability to stimulate cAMP formation in anterior pituitary cells. Three distinct subtypes of PACAP receptors were subsequently characterized, named VPAC1, VPAC2 and PAC1, respectively. The wide distribution of PACAP and its receptors suggests that the PACAP system could be involved in the regulation of numerous physiological processes. Indeed, PACAP, which exists in two biologically active isoforms of 27 and 38-residue respective}y, acts in the central nervous system as weil as in the airways, gonads, endocrine glands and cardiovascular, digestive and immune systems. Particularly, PACAP induces neuronal survival in various in vitro and in vivo models of neurological insults. The neuroprotective properties of PACAP are mainly attributed to its anti-apoptotic activity involving the activation of the PAC1 receptor. Therefore, the PAC1 receptor is actually considered as a potential therapeutic target for the treatment of severa} neurodegenerative diseases. However, as a peptide, the endogenous ligand of the PAC1 receptor shows pharmacokinetics parameters which limit its use as a clinically efficient drug. The development of potent PACl agonists with increased metabolic stability appears as an important issue to evaluate the therapeutic potential of PACAP. A library of PACAP analogs containing chemical modifications targeting potential enzymatic cleavage sites was initially developed to identify derivatives resistant to proteolysis. These compounds were tested for their resistance against dipeptidyl­ peptidase IV, a major enzyme of PACAP metabolism, for their stability in human plasma and for their capacity to bind and activate the PACl receptor. From this library, a PACAP38 analog was shown to be more potent than the native peptide and presented an improved metabolic stability. Evaluation of its neuroprotective activity in a rat cerebral ischemia model showed that this compound significantly reduced the infarct volume and the behavioral deficits. A structure-activity relationships study was also undertaken to acquire valuable information that could eventually support the rational design of short peptides or even non-peptide agonists of the PAC1 receptor. By means of various deletions supported by circular dichroïsm structural studies, we demonstrated that several domains of PACAP27 are crucial for the preservation of the biological activity and that the helical conformation of the peptide is not a sufficient component to allow the binding of PACAP to the PAC1 receptor. Nonetheless, using this approach, we identified a truncated analog of PACAP behaving as a complete agonist of the PAC l receptor even if this peptide was mainly unstructured. We also characterized the molecular and the structural determinants of the N-terminal region of PACAP responsible for the activation of the PAC l receptor. This study conducted to the identification of the pharmacophores of the PACl receptor. Moreover, with introduction of conformational constraints supported by NMR spectroscopy, a model of the bioactive conformation of PACAP was proposed. The results of this study should also lead to a better comprehension of the mode of action of PACAP at the molecular level.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Fournier, Alain
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Vaudry, David (Inserm U413 Université de Rouen)
Mots-clés libres:	pacap
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	25 sept. 2013 18:44
Dernière modification:	02 mars 2022 18:56
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/150

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