Étude de stratégies visant à stimuler la production de protéase alcalines par Bacillus licheniformis en utilisation des boues d'épuration municipales comme substrat.

Drouin, Mathieu (2013). Étude de stratégies visant à stimuler la production de protéase alcalines par Bacillus licheniformis en utilisation des boues d'épuration municipales comme substrat. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 294 p.

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Résumé

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Les présents travaux s'inscrivent dans le cadre d'un projet de recherche visant à mettre au point un procédé de production de protéases alcalines performant et économique en utilisant des boues d'épuration municipales comme substrat de production. Les protéases alcalines produites par des microorganismes tels que Bacillus licheniformis comptent actuellement parmi les enzymes les plus utilisées au niveau industriel. Par contre, l'emploi des enzymes est souvent limité par leurs coûts de production élevés. li est donc indispensable que l'industrie parvienne à produire des enzymes à moindres coûts. Comme une grande partie des coûts de production provient du milieu de culture utilisé, l'emploi de milieux de culture moins coûteux est une solution à privilégier. À ce propos, les boues d'épuration municipales, dont la disposition représente un défi sans cesse grandissant auquel doivent faire face les sociétés, constituent un substrat prometteur. En effet, des travaux antérieurs ont démontré que les boues d'épuration présentent un potentiel intéressant pour la production de protéases. Néanmoins, de nombreux éléments devaient encore être étudiés et optimisés. D'une part, la composition du milieu de fermentation a une grande influence sur la production de protéases. La composition des boues dépend de la composition des eaux usées et du type de traitement des eaux appliqué. De plus, différents composés (ex: floculants, coagulants) sont fréquemment ajoutés dans les eaux usées ou les boues afin d'améliorer les rendements épuratoires des procédés de traitement des eaux, ce qui modifie la composition et les caractéristiques des boues. Une partie de ce travail consistait donc à évaluer l'effet de ces paramètres sur la production de protéases. Également, une proportion importante des nutriments potentiels des boues est sous forme difficilement biodégradable et certaines caractéristiques physiques des boues (présence de flocs, viscosité élevée) sont contraignantes pour la fermentation. Ainsi, ce travail consistait aussi à évaluer le potentiel d'un pré-traitement (hydrolyse thermo-alcaline) des boues visant à en améliorer les caractéristiques physiques et nutritionnelles pour la production de protéases. Les paramètres opérationnels (pH, aération, agitation) qui interviennent dans le procédé de fermentation ont aussi un effet considérable sur la production de protéases. Une partie de ce travail a donc consisté à en étudier leur impact afin de développer des stratégies de gestion adaptées de ces paramètres visant à augmenter les rendements du procédé. Afin de réaliser les objectifs fixés, de nombreux essais de fermentation ont été réalisés en bioréacteurs de 7,5 et 15L, en utilisant comme substrat de fermentation des boues provenant des stations d'épuration des villes de Québec et de Victoriaville. Les résultats ont démontré que la présence de chlorure ferrique dans les boues de la ville de Victoriaville, ajouté durant le procédé de traitement afin de favoriser l'enlèvement du phosphore, ne semble pas avoir d'effet marqué sur la production de protéases. Par contre, l'ajout d'alun et de polymères dans les eaux usées de la ville de Québec, afin de favoriser la floculation et la décantation des particules, a eu un effet bénéfique (+16%) sur la production de protéases. Les activités protéolytiques obtenues dans les boues de la ville de Québec ont été assez constantes (-6% à +9%) d'un échantillon de boue à l'autre, alors que les activités protéolytiques obtenues dans les différents échantillons de boues de la ville de Victoriaville ont présenté de plus importantes variations (-22% à +32%). Les travaux effectués dans les boues de la ville de Québec ont démontré qu'un milieu de culture composé uniquement de boues ayant subi une hydrolyse thermo-alcaline (boues hydrolysées) n'est pas souhaitable pour la production de protéases. En revanche, l'emploi d'un mélange (boues MIX) de boues hydrolysées (25%) et non-hydrolysées (75%) a permis une augmentation considérable de l'activité protéolytique, de l'ordre de 78%, en comparaison avec les boues n'ayant pas subi de pré-traitement (boues RAW). Les protéases produites dans les boues RAW et MIX sont actives sous une vaste gamme de pH et de température et ont généré un maximum d'activité protéolytique à pH 10 et à T 55°C. De faibles concentrations en cellules et production de protéases ont été obtenues en conditions de pH non-contrôlé. En comparaison, les activités protéolytiques obtenues en conditions de pH contrôlé ont été considérablement plus élevées. Dans les boues RAW, les activités protéolytiques ont été 65% plus élevées lors de 1'emploi de NH40H en remplacement de NaOH pour le contrôle du pH. À l'opposé l'emploi de CH3COOH en remplacement de H2S04 a fortement inhibé la production de protéases et donc la combinaison NH40H/H2S04 a été trouvée la plus souhaitable. Dans les boues MIX, l'emploi de NH40H a eu un effet inhibiteur sur la croissance et la production de protéases, et donc la combinaison NaOH/H2S04 est celle qui a permis d'obtenir les activités protéolytiques les plus élevées. Des fermentations ont été menées en employant plusieurs combinaisons de taux d'aération et d'agitation, correspondants à des conditions de transfert d'oxygène faible, moyenne et élevée. Les résultats ont démontré que la production de protéases est grandement stimulée (activité protéolytique/cellule élevée) sous des conditions de transfert d'oxygène élevées (taux agitation et d'aération élevés). Cependant, lorsque de telles conditions ont été maintenues tout au long de la fermentation, de faibles concentrations en cellules ont été obtenues, affectant négativement les activités protéolytiques. De plus, la formation abondante de mousse associée à des taux d'agitation et d'aération élevés s'est avérée très problématique, particulièrement pendant les premières heures de la fermentation. À l'opposé, la chute des concentrations en oxygène dissous sous la barre des 10% de saturation lors de l'emploi de plus faibles taux d'aération et d'agitation a fortement inhibé la production de protéases. L'emploi de conditions de transfert d'oxygène variables (taux d'agitation et d'aération variables) tenant compte des résultats précédemment cités à permis d'augmenter considérablement les activités protéolytiques tout en limitant la formation de mousse pendant la fermentation. La centrifugation du bouillon de fermentation permet de récupérer les enzymes dans le surnageant des boues. Cependant, il a été démontré qu'une quantité appréciable de protéases demeure adsorbée sur les solides des boues et n'est donc pas récupérée lors de l'étape de la centrifugation. L'augmentation du pH du bouillon de fermentation de 7,5 à 10 avant la centrifugation à permis une désorption efficace des protéases, résultant en des augmentations d'activités protéolytiques de l'ordre de 11% et 12% dans les boues RAW et MIX, respectivement. La combinaison de toutes les conditions (pH, agitation, aération, désorption) les plus favorables pour la production de protéases dans les boues a permis d'augmenter considérablement les activités protéolytiques obtenues: les protéases produites dans les boues RAW et MIX lors de cette dernière série de fermentations ont généré des activités maximales de 66.74 U.I./ml et 80.93 U.I./ml, respectivement, à pH 10 et à T 55°C. Il a aussi été démontré que l'emploi des boues pour la production de protéases permet une diminution importante du volume de boues résiduelles.

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The present work is part of a research project which is aimed at developing an effective and economic protease production process using municipal wastewater sludge as raw material. Alkaline proteases produced by microorganism such as Bacillus licheniformis are among the most used industrial enzymes. However, the use of enzymes is often limited by their high production costs. Thus, it is indispensible for industry to find cheaper ways to produce enzymes. As a great part of production costs originate from the culture medium, the use of cheaper raw materials is an interesting avenue. In this vein, municipal wastewater sludge, whose disposal is an increasing challenge which many societies have to face, constitutes a promising raw material. Previous works have showed that wastewater sludge represents a great potential for protease production. Neverthe1ess, many elements still have to be studied and optimized. First, the composition of the fermentation media is having a great influence on protease production. The wastewater sludge composition depends on wastewater composition and on the type of wastewater treatment applied. Also, various compounds (flocculants, coagulants) are often added into wastewaters or sludge in order to increase the purification yie1ds of the treatment processes, which can modify composition and characteristics of sludge. So, a part of this work consisted in the evaluation of the effect of theses parameters on protease production. Also, a significant portion of sludge potential nutrients is the parts of which are difficult to biodegrade, and some sludge inconvenient physical characteristics (presence of flocks, high viscosity) restrained the potential of sludge as a fermentation media. Thus, another part of this work was to evaluate the potential of a pre-treatment (thermal-alkaline hydrolysis) to improve the sludge physical and nutritional characteristics for protease production. Moreover, the operational parameters (pH, aeration, agitation) in fermentation processes also have a considerable effect on protease production. The impact of theses parameters was also studied in order to increase protease production yields using activated sludge. In order to attain the different fixed objectives, many fermentation essays were realized in 7.5 and 15 L bioreactors, using sludge from Québec and Victoriaville municipal wastewater treatment plants. With the Sludge from Victoriaville, the results demonstrated that the presence of ferric chloride, added during the treatment process in order to favor phosphorus removal, did not affect protease production. On the other hand, the addition of alum and polymers in Québec wastewaters in order to favor the partic1es flocculation and sedimentation had a beneficial effect (+16%) on protease production. The protease activities obtained in Québec sludge were fairly constant (-6% to +9%) from one batch to another, whereas the protease activities obtained in the different sludge batches from Victoriaville presented more considerable variations (-22% to +32%). The results obtained in Québec sludge demonstrated that a fermentation medium consisting of thermal-alkaline (hydrolyzed) pre-treated sludge only is not suitable for protease production. On the other hand, the use of a mixture (MIX sludge) of hydrolyzed sludge (25%) and non-hydrolyzed sludge (75%) permitted a significant increase (78%) in protease activities, in comparison with non-pretreated sludge (RAW sludge) only. The proteases produced in RAW and MIX sludge are active under wide pH and temperature ranges and generated maximum protease activity at pH 10 and T 55°C. Low cell concentration and protease activities were obtained under uncontrolled pH conditions. In comparison, the protease activities obtained under controlled pH conditions were considerably higher. In RAW sludge, the proteases activities were 65% higher when NH40H was employed in replacement of NaOH as pH-control agent. On the other hand, the use of CH3COOH in replacement of H2S04 significantly inhibited protease production. Therefore, NH40H/H2S04 was found the most suitable combination of pH-control agents. In MIX sludge, the use of NH40H had an inhibition effect on cell growth and protease production and the NaOH/H2S04 combination permitted to obtain the highest protease activities. Fermentations were carried under different combinations of aeration and agitation rates, c1assified as low, medium and high oxygen transfer conditions. The results demonstrated that protease production was highly stimulated (high protease activity/cells) under high oxygen transfer conditions (high aeration and agitation rates). However, when such conditions were maintained throughout the whole fermentation, low cell concentrations and low protease activities were obtained. Also, the abundant foam formation associated with high aeration and agitation rates was a major concern, more particularly during the first hours of the fermentation. On the other hand, the drop of dissolved oxygen concentrations below 10% when lower agitation and aeration rates were employed strongly inhibited protease production. Thus, the use of variable oxygen transfer conditions (variable agitation and aeration rates) taking into account the aforementioned results permitted a significant increase in protease activities, as well as a better foam control during fermentation. At the end of the fermentation, the centrifugation of the fermentation broth allows the recovery of the protease in the supernatant, but the present work demonstrated that an appreciable amount of protease stay adsorbed on the solid fraction and is not recovered by the centrifugation step. However, the increase of the fermentation broth pH from 7.5 to 10 before the centrifugation step permitted a more efficient recovery of protease, resulting in increases of 1l % and 12% of protease activity in RAW and MIX sludge, respectively. The combination of all the aforementioned most suitable conditions for protease production in sludge resulted in an important increase in protease activities: maximum protease activities produced in RAW and MIX sludge under all the combined optimal conditions were 66.74 I.U./ml and 80.93 I.U./ml, respectively, at pH 10 and T 55°C. It also have been demonstrated that the protease production process from sludge allowed a considerable residual sludge volume reduction.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Tyagi, Rajeshwar Dayal
Informations complémentaires:	Résumé avec symboles
Mots-clés libres:	protéases alcalines; Bacillus licheniformis; prétraitement, boues d'épuration; biodégradabilité
Centre:	Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt:	27 août 2013 14:33
Dernière modification:	23 juill. 2024 13:22
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/1496

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