Recherche de nouvelles molécules antimicrobiennes actives contre Staphyloccocus aureus résistant à la méthicilline par métagénomique fonctionnelle

Brahami, Anissa (2019). Recherche de nouvelles molécules antimicrobiennes actives contre Staphyloccocus aureus résistant à la méthicilline par métagénomique fonctionnelle Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 230 p.

Prévisualisation

PDF - Version publiée Télécharger (27MB) | Prévisualisation

Résumé

La résistance aux antibiotiques représente un défi important pour la santé publique mondiale. Il y a donc urgence de découvrir de nouveaux antibiotiques efficaces contre ces bactéries multirésistantes.

Etant donné que les microorganismes du sol sont à l’origine de la plupart des antibiotiques connus et utilisés mais que la grande majorité des microorganismes demeure incultivable au laboratoire, la métagénomique fonctionnelle permet un accès à ce potentiel génétique qui représente une source prometteuse de nouveaux antibiotiques.

L’hypothèse exploitée est qu’un environnement enrichi en BMR sélectionnera positivement par antibiose la croissance de bactéries capables de compétitionner grâce à la production d’antibiotiques efficaces contre ces BMR. De ce fait, dans un premier temps, la construction de banques d’ADN génomiques en utilisant l’hôte d’expression Escherichia coli DH10B a été effectuée. Nous avons démontré comment la déphosphorylation de l’ADN du vecteur / déphosphorylation de l’ADNe, l'inactivation de la ligase après ligation, la dialyse du produit de ligation et le rapport ADN vecteur / ADN génomique influencent l’efficacité de transformation. De plus, nous avons décrit l’utilisation d’un aérographe pour le criblage fonctionnel de cette banque d’ADN génomique construite en vaporisant la bactérie cible Staphylococcus aureus souche Newman. Cette approche de criblage fonctionnel permettant de détecter la plus petite zone d’inhibition produite par les clones transformants a été nommée bacteriospray. Une fine et uniforme couche de bactéries cible est déposée, ce qui permet le criblage de 5 à 10 fois plus de clones que la méthode de double couche d’agar conventionnelle. Pour valider cette méthode, l’ADN génomique de Burkholderia thailandensis E264 a servi à la construction d’une banque d’ADN où quatre des 70,000 clones criblés inhibaient la croissance de S. aureus. L’analyse des inserts de ces clones actifs a révélé que ces régions génomiques n’avaient jamais été rapportées responsables de la production de molécules antimicrobiennes.

Par la suite, l’ADN de biofilms de différents hôpitaux a été utilisé pour la construction et l’expression hétérologue de l’ADN chez Escherichia coli DH10B à l’aide du vecteur pBeloBAC11 suivant les méthodes optimisées. Le criblage fonctionnel par bacteriospray de 150,000 clones contre Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) a permis d’identifier 10 clones actifs. Certains clones avaient des morphologies particulières en étoiles ou formaient de petites colonies, mais un clone en particulier présentait un défaut de croissance en milieu liquide et en milieu solide. Le résultat BLASTx de la séquence indique 100% de similarité avec la sous unité de la cobaltochelatase CobN de Mycobacterium sp. Une analyse des cadres de lecture ouverts avec le codon ATG comme codon de départ a révélé deux différents peptides qui ont été synthétisés sur support solide afin de tester leur activité. Une prédiction structurale, une analyse par dichroïsme circulaire ainsi qu’une analyse par résonance magnétique nucléaire de ces deux peptides ont montré que le peptide-1 (dérivé de ORF1) adopte une conformation en α-hélice, une structure commune aux peptides antibactériens, tandis que le peptide-2 (dérivé de ORF2) adopte une structure aléatoire. Un résultat inattendu obtenu était que le peptide-2 était faiblement actif contre SARM alors que le peptide-1 ne présentait aucune activité. Des études de structure-activité sont proposées en perspective pour améliorer l’activité biologique du peptide-2.

Les résultats obtenus au cours de cette thèse nous ont en premier lieu permis d’améliorer notre compréhension des facteurs influençant l’expression hétérologue d’ADN exogène, particulièrement en métagénomique fonctionnelle. En deuxième lieu, le développement de la nouvelle technique de criblage décrite dans cette thèse pourra contribuer à accélérer la découverte de nouveaux antibiotiques en permettant le criblage de volumineuses librairies métagénomiques d’ADNe. Finalement, l’identification d’un peptide antimicrobien en exploitant l’ADNe d’environnements riches en microorganismes multirésistants tels les biofilms hospitaliers encouragera la communauté scientifique à explorer davantage de telles sources d’ADNe pour la découverte d’antibiotiques capables d’éradiquer les bactéries multirésistantes.

Multidrug-resistant infections represent a serious human threat and there is therefore an urgent need for the discovery of new effective antibiotics.

Since soil microorganisms produce most of the antibiotics currently known and used in human medicine, but that most microorganisms cannot be cultured using standard laboratory conditions, functional metagenomics is a key method for the identification of new metabolites as it allows on to the access to a promising source of genetic material.

The hypothesis exploited in this study is that competition between environmental microbes might select for the evolution of antibiotics able to bypass current antibiotic resistance mechanisms. As a first step, we developed a detailed genomic library construction approach using Escherichia coli DH10B as a surrogate host, and demonstrated how vector or genomic DNA dephosphorylation, ligase inactivation, dialysis of the ligation product and vector/genomic DNA ratio greatly influence the transformation efficiency. Furthermore, we described the use of an airbrush device to screen E. coli metagenomic libraries for their antibacterial activity against Staphylococcus aureus, a method we called Bacteriospray. This method facilitates the identification of new antimicrobials among large metagenomic libraries. This bacterial spraying tool greatly improves the functional screening of large genomic libraries, as it conveniently allows the production of a thinner and a more uniform layer of target bacteria compared to the commonly used overlay method, resulting in the screening of 5–10 times more clones per agar plate. Using Burkholderia thailandensis E264 genomic DNA as a proof of concept, four clones out of 70,000 inhibited the growth of S. aureus and were found to each contain a DNA insert. Analysis of these inserted DNA fragments revealed genomic regions never previously reported to be responsible for the production of antimicrobials, or predicted by bioinformatics tools.

Thereafter, DNA from different hospital biofilms was used to construct and express Escherichia coli DH10 B libraries with BAC vectors (Bacterial Artificial Chromosome) using the previously optimized method mentioned above. The functional screening of 150,000 clones against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) using the bacteriospray method allowed the identification of ten active clones. Some clones displayed particular star-shaped morphologies or formed small colonies, but a unique E. coli transformant clone was characterized by a growth defect in liquid and solid media. The inserted DNA was 100% identical to a part of gene sequence predicted to contain the cobaltochelatase subunit (CobN) of Mycobacterium sp. A blast ORF finder analysis using ATG as a start codon revealed two different potential peptides that were synthesized on solid support to validate their activity. Structural modeling, circular dichroism analysis and nuclear magnetic resonance analysis of the two synthetic peptides showed that peptide-1 (derived from ORF1) adopts an α-helix conformation, a structure commonly observed among antibacterial peptides, whereas peptide-2 (derived from ORF2) is unstructured.

Results showed that peptide-2 was effective against MRSA whereas peptide-1 was found inactive. Structure-activity relationship studies are proposed to improve the biological activity of peptide-2. Results obtained in the course of this thesis allowed us to improve our understanding of several factors influencing the heterologous expression of foreign DNA, particularly in the context of functional metagenomics. In addition, the development of the new screening tool presented here will facilitate the discovery of new antibiotics by allowing the screening of large eDNA metagenomic libraries. Finally, the identification of an antimicrobial peptide obtained by exploiting eDNA from multidrug-resistant microorganism-rich environments such as hospital biofilms will likely prompt the scientific community to explore such eDNA (environmental DNA) sources for the discovery of antibiotics able to eradicate multidrug-resistant bacteria.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Castonguay, Annie
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Déziel, Éric
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	18 juill. 2023 14:07
Dernière modification:	18 juill. 2023 14:07
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/13315

Gestion Actions (Identification requise)

Modifier la notice