Caractérisation de l’autophagie et de la sécrétion des exosomes lors de la réplication du virus d’hépatite delta (VHD)

Khabir, Marwa (2020). Caractérisation de l’autophagie et de la sécrétion des exosomes lors de la réplication du virus d’hépatite delta (VHD) Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 218 p.

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Résumé

Le virus de l’hépatite B (VHB) est le principal agent étiologique responsable du cancer du foie à travers le monde. Actuellement, il est estimé que 257 millions d’individus sont chroniquement infectés par ce virus. Parmi ces individus, 17 millions sont également porteurs du virus de l’hépatite delta (VHD). Le VHD est un virus satellite qui requiert le VHB pour compléter son cycle de réplication. Une co-infection par les VHB et VHD aggrave significativement les risques de complications hépatiques chez les patients. Par conséquent, il est crucial de comprendre les facteurs de l’hôte qui favorisent la réplication de ces virus et l’établissement de leur chronicité. L’infection virale provoque un stress cellulaire qui pourrait induire différents processus biologiques tels que l’autophagie et la sécrétion des exosomes. Dans une première partie, nous avons analysé l’impact de la réplication de VHB et VHD sur l’autophagie. Nous avons étudié l’implication du processus autophagique dans le cycle de réplication du VHD en cas de mono-expression ou de co-expression avec le VHB. Nos résultats montrent que les protéines HBx et S-AgHBs induisent l’autophagie. De plus, les deux isoformes de l’antigène delta (AgHD), S-AgHD et L-AgHD, provoquent l’accumulation des autophagosomes et perturbent le flux autophagique. Nous avons exploité la technologie « CRISPR-Cas9 » pour générer des cellules « knockout » pour différents gènes autophagiques. Nos résultats montrent que la machinerie autophagique, spécifiquement les protéines impliquées dans les étapes d’élongation des autophagosomes, soit ATG7, ATG5 et LC3, est importante pour la sécrétion des virions du VHB. Cependant, la réplication intracellulaire du génome du VHB n’est pas affectée. Il est intéressant de noter que l’inhibition d’expression d’ATG5 provoque une diminution du niveau d’ARN viral intracellulaire du VHD. En revanche, dans les mêmes conditions, nous n’avons pas observé un effet additionnel sur la sécrétion du VHD (cette étude a été publiée dans « Journal of Virology »). Dans une seconde partie, nous avons étudié la possible transmission du VHD, indépendante du VHB, à travers les exosomes. Ainsi, nos résultats montrent que l’expression de protéines du VHD seules ou en association avec l’ARN du VHD (RNP) provoque une augmentation de la concentration des vésicules extracellulaires. De plus, nous avons constaté que les exosomes isolés des cellules qui expriment la ribonucléoprotéine, la S-AgHD et la L-AgHD contiennent l’AgHD sous les deux isoformes. Il était intéressant de montrer que les cellules Huh7 naïves incubées avec des exosomes purifiés de cellules qui expriment la ribonucléoprotéine accumulent l’ARN viral du VHD dans la cellule. En conclusion, d’une part, nous avons mis en évidence que les deux virus VHB et VHD profitent de la machinerie autophagique pour assurer leurs cycles de réplication. D’autre part, nous avons découvert que les composantes virales du VHD se retrouvent dans les exosomes. Par conséquent, le VHD pourrait propager entre les hépatocytes en absence du VHB et il pourrait aussi propager dans les PBMCs pour moduler la réponse immunitaire.

The hepatitis B virus (HBV) is the main etiological agent responsible for liver cancer worldwide. Currently, it is estimated that 257 million people are chronically infected with this virus. Among those people, 17 million are also carriers of the hepatitis Delta virus (HDV). The HDV is a satellite virus that requires HBV to complete its replication cycle. Co-infection with HBV and HDV increases significantly the risk of liver complications in patients. Therefore, it is crucial to understand the host factors that promote the replication of these viruses and the establishment of their persistence. The viral infection causes cellular stress which could induce various cellular processes such as autophagy and the secretion of exosomes. In the first part, we analyzed the impact of HBV and HDV replication on autophagy. We studied the implication of the autophagic process in the replication cycle of HDV in case of mono-expression or co-expression with HBV. Our results show that HBV proteins HBx and S-HBsAg induce autophagy. In addition, the two isoforms of the delta antigen (HDAg), S-HDAg and L-HDAg, cause the accumulation of autophagosomes and disrupt the autophagic flux. We exploited «CRISPR-Cas9» technology to generate «knockout» cells for different autophagic genes. Our results show that the autophagic machinery, specifically the proteins involved in the stage of elongation of the autophagosomes, namely ATG7, ATG5 and LC3, are important for the secretion of HBV virions. However, intracellular replication of the HBV genome is not affected. Interestingly, inhibition of ATG5 expression causes a decrease in the level of intracellular HDV RNA in our cell model. However, under the same conditions, we did not observe an additional effect on the secretion of HDV (This study was published in «Journal of Virology»). In the second part, we studied the putative transmission of HDV, independent of HBV, through exosomes. Our results show that the expression of HDV proteins, only or on association with the HDV RNA (RNP) causes an increase in the concentration of secreted extracellular vesicles. In addition, we found that exosomes isolated from cells that express HDV proteins (S-HDAg and L-HDAg) separately or on association with HDV RNA (RNP) harbor the two isoforms of HDAg. It was interesting to show that naïve Huh7 cells incubated with purified exosomes from cells that express RNP accumulate the viral RNA of HDV within the cell. In conclusion, on the one hand, we have highlighted that the two HBV and HDV viruses take advantage of the autophagic machinery to ensure their replication cycles. On the other hand, we discovered that the viral HDV components are found in the exosomes. Therefore, HDV could propagate to other hepatocytes in the absence of HBV or it could enter PBMCs cells to modulate the immune response.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Labonté, Patrick
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Blanchet, Matthieu
Mots-clés libres:	VHD; VHB; autophagie; exosome; HDV; HBV; autophagy
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	15 juill. 2021 14:51
Dernière modification:	02 mars 2022 13:16
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/11195

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