Charbonneau, Anne
(1992).
Expression de gènes du virus de la mosaïque du navet dans E. Coli
Mémoire.
Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maitrise en microbiologie appliquée, 126 p.
Résumé
Des ADNe du virus de la mosaïque du navet (TuMV) ont été sous-clonés
dans un des vecteurs d'expression pET-11 et exprimés dans la bactérie Escherichia
coli. Le premier ADNe, sous-cloné dans le vecteur pET-lld, incluait le gène de la
protéine de la capside (plasmide pACt). Le deuxième ADNe, sous-cloné dans le
vecteur pET-lla, incluait les gènes des protéines virales 0, 6K, Nia et Nib
(plasmide pAC2). Le troisième, également sous-cloné dans le vecteur pET-lla,
portait les gènes du plasmide pAC2 et, en plus, l'extrémité 3' du gène de la Nib et
le gène complet de la protéine de la capside (plasmide pAC3). Les plasmides ont
été introduits dans la bactérie Blr21 (DE-3) et les protéines bactériennes ont été
analysées pour la production des protéines recombinantes. Ces transformations ont
produit trois nouvelles souches numérotées respectivement 164, 180, 189. La souche
164 qui contenait le plasmide codant pour la capside a été induite et les produits de
l'expression ont été électrophorés en gel de polyacrylamide et analysés par coloration
du gel au bleu de coomassie et par immunodétection. La protéine majeure observée
et représentant 30% des protéines totales de E. coli BL-21 (DE-3) correspondait à
la protéine de la capside telle que confirmée par l'immunodétection. Les produits
d'expression des souches 180 et 189, portant les ADNe de polyprotéines virales, ont
été analysés par coloration des gels de polyacrylamide au bleu de coomassie, par
marquage des protéines à la méthionine-[35S] et par immunodétection. Les différents
résultats ont montré que la protéase virale incluse dans la polyprotéine produite par
les souches 180 et 189 était active dansE. coli. Les principaux produits de protéolyse visibles au bleu de coomassie correspondaient à la protéine CI et au dimère CI-6K
provenant de la protéolyse de l'extrémité aminée des deux ADNe. Ces produits
étaient aussi détectés par le marquage des protéines à la méthionine-[15S] et leur
identité a été confirmée par l'immunodétection effectuée avec les anti-CI du TEV.
Les produits de protéolyse de l'extrémité carboxyle des souches 180 et 189 ont été
identifiés par immunodétection. La protéine d'environ 21 kDa produite dans la
souche 180 et détectée par les anti-NI du TEV correspondrait à la protéase Nib
tronquée. La protéine de la capside produite dans la souche 189 et détectée par les
anti-capsides du TuMV a un poids moléculaire inférieur à la protéine de la capside
native de 3000. Aucune protéase (Nia) libre n'est détectée indiquant, par ce fait,
que la protéase virale coupe les différents sites de la polyprotéine en étant unie à
d'autres protéines.
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