Évaluation des glycosyles hydrolases de Streptomyces lividans pour la production d'oligosaccharides par glycosynthèse.

Fex, Pascal (2001). Évaluation des glycosyles hydrolases de Streptomyces lividans pour la production d'oligosaccharides par glycosynthèse. Mémoire. Québec, Université du Québec. Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 121 p.

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Résumé

La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF.Des méthodes efficaces de synthèses d'oligosaccharides ne sont pas disponibles malgré l'importance de cette classe de biomolécules au niveau de plusieurs processus biologiques et en tant qu'agents thérapeutiques. En effet, les méthodes chimiques et enzymatiques via les glycosyltransférases et les glycosidases par le mode de transglycosylation ont été exploitées mais se sont avérées non efficaces pour une production à grande échelle.Dernièrement, une nouvelle méthode mettant à profit l'utilisation de glycosidases de rétention spécifiquement mutées a été élaborée et semble prometteuse. En effet, parmi les deux résidus d'acide aminé du site actif responsables de l'activité d'hydrolyse (Glu ou Asp), la substitution par une alanine du résidu nucléophilique a pour effet d'inactiver l'activité glycosidique de l'enzyme et du même coup rend possible la synthèse d'oligosaccharides. En conjonction avec un sucre donneur activé de configuration anomérique opposé au substrat normal et en présence d'un sucre accepteur approprié, l'enzyme mutée peut efficacement effectuer la synthèse d'oligosaccharides. D'excellents rendements de synthèse ont été obtenus (> 90%) pour l'enzyme mutée 13-glucosidase/galactosidase d'Agrobacterium (Mackenzie et al., 1998) et l'enzyme mutée 1 ,3-1 ,4-13-glucanase de Bac ill us licheniformis (Malet et Planas, 1998). Streptomyces lividans est une bactérie qui produit des glycosidases de rétention dont entre autres les xylanases A, B et C. L'objectif général du projet est de muter spécifiquement ces glycosyles hydrolases et d'évaluer leur capacité à synthétiser des oligosaccharides par cette réaction appelée glycosynthèse. Le résidu catalytique nucléophile des enzymes a donc été substitué par une alanine à 1' aide de la muta genèse dirigée par PCR. Suite à leur production et leur purification, l'activité résiduelle d'hydrolyse des enzymes mutées a été déterminée. Cependant, les résultats ont démontré que chacune des enzymes mutées possèdent une activité résiduelle d'hydrolyse. L'enzyme mutée XlnA2-E236A a présenté l'activité résiduelle d'hydrolyse la plus faible avec une valeur moyenne de 0,02% lorsque comparé à l'enzyme sauvage correspondante. De son côté, l'enzyme mutée XlnC-E85A a démontré une valeur moyenne d'activité résiduelle d'hydrolyse de 0,20%. Quant à l'enzyme mutée XlnB2-E8A, des valeurs beaucoup plus élevées s'élevant jusqu'à 11,9% ont été obtenues.Non disponible commercialement, le sucre donneur activé nécessaire à la réaction de glycosynthèse a par ailleurs été synthétisé. Parmi les nombreuses synthèses effectuées, seulement deux ont menées au sucre donneur activé 1-fluoroxylobiose. Des rendements très faibles, soit de 1,1% et 1,3%, ont cependant été obtenus. La première synthèse a fournit le sucre donneur fluoré sous une forme brute tandis qu'une forme pure a été obtenue lors de la seconde synthèse. Une première série de tests de glycosynthèse des enzymes mutées a été effectuée avec le sucre donneur fluoré sous forme brute et différents sucres accepteurs. Seules les enzymes mutées XlnA2-E236A et XlnB2-E8? A lorsque mises en présence du sucre donneur fluoré et du sucre accepteur xylotriose ont démontré, mais à un niveau très faible, un phénomène de synthèse. Par contre, ces résultats n'ont pu être reproduits lors de la seconde série de tests de glycosynthèse avec le sucre donneur fluoré sous forme pure.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Dupont, Claude
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Lépine, François
Informations complémentaires:	Résumé avec symboles
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	28 sept. 2016 18:36
Dernière modification:	02 mars 2022 20:31
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/4475

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