Pseudoplusia includens densovirus (PiDNV) genome organization and expression strategy

Huynh, Oanh Thi Hoang (2012). Pseudoplusia includens densovirus (PiDNV) genome organization and expression strategy Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 92 p.

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Résumé

La famille de Parvoviridae regroupe des virus de petite taille (215-255 Â) sans enveloppe dont la capside est de symétrie icosaédrique et dont le génome est une molécule d'ADN simple brin d'une taille comprise entre 4 et 6 kb. Cette famille se subdivise en deux sous-familles, celles des Parvovirinae regroupant les virus qui infectent les vertébrés et celle des Densovirinae regroupant les virus pathogènes d'invertébrés (68). Environ la moitié seulement des densovirus isolés à ce jour sont classés, faute de caractérisation suffisante de leur génome. Le densovirus de Pseudoplusia includens (PiDNV), objet de notre étude, a été isolé par Chao et al. (13) à partir des larves de ce lépidoptère. Les particules de PiDNV sont icosaédriques et contiennent une molécule d'ADN linéaire simple brin de 6 kb. À chaque extrémité de la molécule une répétition terminale inversée (ITR) correspondant à 6-7% de la taille du génome permet, par appariement des séquences complémentaires, la formation d'une structure en forme de «poêle à frire» (panhandle-like structure) observable au microscope électronique (13). L'électrophorèse en gel dénaturant SDS-polyacrylamide a révélé 4 protéines virales VPI-4 de 87 à 46 kDa. Par immunodiffusion, une réaction croisée partielle a été observée entre le virus GmDNV et le PiDNV (13). Pseudoplusia includens, l'hôte du PiDNV, a une aire de répartition s'étendant sur tout le continent américain (Nord et Sud). Il s'agit d'une espèce polyphage pouvant se nourrir non seulement sur le soja mais aussi d'autres plantes économiquement importantes comme la patate douce, l'arachide, le coton, la tomate, les crucifères, etc. (12). En conséquence, le virus PiDNV peut être utilisé comme un agent de lutte biologique contre ce ravageur. Cependant, depuis la première caractérisation de Chao et al. (13), aucune caractérisation moléculaire de son génome n'a été pas faite. Nous reportons dans ce mémoire les résultats du clonage et du séquençage du génome du PiDNV ainsi que l'analyse de son organisation et de sa stratégie d'expression. Nous avons purifié le PiDNV à partir des larves de Pseudoplusia includens, qui ont été fournies par le Dr. Yu-Chan Chao en 2000. Le génome du virus a été extrait et son analyse en gel d'agarose a permis de visualiser d'une bande de 6 kb. Ce génome a été coupé en deux moitiés par 1'enzyme de restriction Clal et les deux moitiés ont été clonées dans le vecteur pBluescript KS ( ) et séquencées. Le séquençage de la région interne du génome, entre les répétitions terminales inversées (ITRs), n'a pas posé de problème. Par contre, le séquençage des ITRs dont l'appariement de séquences complémentaires génère des structures en « épingles à cheveux» (hairpins) s'est avéré plus difficile et on a dû faire appel à différentes stratégies pour obtenir ces séquences. Ainsi, l'épingle à cheveux à chaque extrémité du génome viral dans un clone a été coupée au site de restriction BstUI en deux moitiés et chaque moitié a été clonée puis séquencée séparément. Cette approche a permis d'obtenir la séquence de l'extrémité 3' mais pas celle de l'extrémité 5'. Le génome complet de PiDNV a été également cloné dans le vecteur linéaire pJAZZ-OC spécialement adapté au clonage d'ADN difficile à cloner (31). Seulement 6 clones positifs ont été obtenus à partir de 1848 colonies (0.3%). Ces clones ont été séquencés et leur séquençage a confirmé la séquence obtenue avec les séquences clonées dans pBluescript sans toutefois fournir la séquence de 1'épingle à cheveux à 1'extrémité 5'. Nous avons alors amplifié par PCR les ITRs en présence de trois additifs: la bétaine, le DMSO et le 7-deaza dGTP...

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Tijssen, Peter
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Ozaki, Tsuneyuki
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	09 nov. 2015 19:49
Dernière modification:	03 févr. 2021 16:35
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/2397

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