Mélatonine et l’hypoxie-réoxygenation régulent différemment l’autophagie et l’inflammation dans le trophoblaste placentaire humain

Sagrillo-Fagundes, Lucas (2018). Mélatonine et l’hypoxie-réoxygenation régulent différemment l’autophagie et l’inflammation dans le trophoblaste placentaire humain Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 243 p.

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Résumé

L’apport en oxygène dans le placenta est finement régulé et directement lié avec le bon déroulement de la grossesse et du développement foetal. Dans les pathologies de grossesses associées avec un remodelage artériel incomplet, telles que la prééclampsie, l’apport d’oxygène est plus faible et intermittent entraînant une hypoxie/réoxygénation (H/R). Cette H/R est associée avec une augmentation du stress oxydatif et de l’apoptose des trophoblastes villeux. Il n’existe aucun traitement thérapeutique ou préventif pour la prééclampsie excepté l’accouchement. La mélatonine est produite de novo par les cellules trophoblastiques humaines. Cette indolamine exerce diverses actions protectrices telles que antioxydante, anti-inflammatoire et régulation de l’autophagie. Au niveau placentaire, la mélatonine protège les trophoblastes des dommages induits par l’H/R, entre autres, par une action antioxydante directe et indirecte, via ses récepteurs MT1 et MT2. Par contre, sa capacité de diminuer l’inflammation et de réguler l’autophagie induite par une H/R trophoblastique n’a jamais été étudiée. Les hypothèses de recherche sont : la mélatonine (1) via la régulation de l’autophagie et de l’inflammation protège le trophoblaste villeux contre les dommages induits par l’H/R ; et (2) module différemment l’autophagie pour maintenir la survie/l’homéostasie des cellules trophoblastiques normales et induire la mort des cellules tumorales. L’objectif général est de comprendre comment la mélatonine module l’autophagie des cellules placentaires (primaires et tumorales) en situation de stress. Les objectifs spécifiques sont 1) Déterminer si et par quelle voie de signalisation la mélatonine régule l’inflammation et l’autophagie dans le syncytiotrophoblaste primaire humain cultivé en normoxie et H/R ; 2) Déterminer si la mélatonine régule différemment l’autophagie dans les cellules trophoblastiques normales (primocultures) et tumorales (cellules BeWo). Les expériences ont été réalisées avec la lignée cellulaire BeWo (lignée cellulaire de choriocarcinome placentaire humain) et avec des cultures primaires de trophoblastes villeux de placentas normaux à terme. Toutes les expériences ont été conduites sous conditions de normoxie (8 % O2) mimant l’espace intervilleux. Pour mimer l’H/R, la normoxie a été suivie par 4 h d’hypoxie (0,5 % O2) puis 18 h de normoxie. Les cellules ont été traitées ou non avec 1 mM de mélatonine à toutes les 24 h. L’expression protéique des biomarqueurs de l’autophagie, de l’inflammation et de l’apoptose a été déterminée par immunobuvardage de type western, par immunofluorescence, par immunohistochimie et à l’aide de la trousse MILLIPLEX MAP ; la mélatonine a été mesurée par ELISA. L’exposition in vitro du syncytiotrophoblaste à l’H/R réduit la production endogène de mélatonine et induit une réponse pro-inflammatoire par l’augmentation des facteurs TNF, IL-6 et NFκB. Au contraire, le traitement avec 1 mM mélatonine augmente les taux d'IL-10 et rétablit les taux de TNF, d'IL-6 et NFκB aux taux observés en normoxie. L’H/R augmente également l'autophagie dans le syncytiotrophoblaste. La mélatonine et l'inhibition spécifique du NFKB induisent également l'autophagie et augmente la survie cellulaire en condition d’H/R. Dans les cellules BeWo, l’H/R avec et sans mélatonine réduit la viabilité cellulaire et induit l'activation des capteurs d'énergie cellulaire comme le AMPK et le PP2A-C, qui sont des modulateurs en amont de l’autophagie. Dans les BeWo, l'H/R a induit la formation de l'autophagosome, l'activité autophagique et l’activité du facteur de transcription Nrf2. La mélatonine, dans les conditions d'H/R, a réduit l'activation de l’autophagie et du Nrf2, ce qui a entrainé l'activation de l'apoptose. Dans les primocultures de cytotrophoblastes villeux, l’H/R a aussi induit l'autophagie et Nrf2. Par contre, la mélatonine a augmenté l’activité de l’autophagie et du Nrf2 protégeant les cellules primaires contre les effets de l’H/R. Puisque la mélatonine est impliquée dans les mécanismes de survie cellulaire des trophoblastes primaires, ses actions pourraient avoir un effet bénéfique sur la santé de la grossesse et sur le développement du foetus.

The oxygen supply in the placenta is finely regulated and directly related to the good progress of pregnancy and fetal development. In addition, in pregnancy pathologies associated with incomplete arterial remodeling, such as pre-eclampsia, the oxygen supply is lower and intermittent resulting in hypoxia/reoxygenation (H/R). The H/R is at the origin of the trophoblastic oxidative stress and trophoblastic and maternal inflammation. H/R is associated with increased oxidative stress and apoptosis of villous trophoblasts. There is no therapeutic or preventive treatment for these pathologies that can reduce their effects before delivery. In addition, melatonin is produced de novo by human trophoblast cells. Melatonin exerts various protective actions such as antioxidants, anti-inflammatory and via the regulation of autophagy in various tissues. At the placental level, melatonin protects trophoblasts from H/R-induced damage, including direct and indirect antioxidant action through its MT1 and MT2 receptors. On the other hand, its ability to decrease H/R-induced trophoblastic inflammation and to regulate the trophoblastic autophagy has never been studied. The research hypotheses are: melatonin (1), via the regulation of autophagy and inflammation, protects the villous trophoblast against H/R-induced damages; and (2) modulates autophagy differently to maintain normal trophoblastic cell survival/homoeostasis and induce tumour cell death. The overall goal is to understand how melatonin modulates placental (primary and tumour) cell autophagy in stressful situations. The specific objectives are 1) to determine if and by which signalling pathway melatonin regulates inflammation and autophagy in the human primary syncytiotrophoblast cultured in normoxia and H/R; 2) determine if melatonin regulates autophagy differently in normal trophoblastic cells (primary cell culture) and tumours (BeWo cells). The experiments were carried out on the BeWo cell line (human placental choriocarcinoma cell line), on primary cultures of villous trophoblasts of normal placentas at term. All experiments were conducted under normoxic conditions (8% O2) mimicking the intervillous space. To mimic an H/R situation, normoxia was followed by 4 h of hypoxia (0.5% O2) and then 18 h of normoxia. The cells were treated or not with 1 mm melatonin every 24 hours. The protein expression of the biomarkers of autophagy, inflammation and, apoptosis was determined by western immunoblotting, immunofluorescence and immunohistochemistry. The quantification of inflammatory factors was performed using the MILLIPLEX MAP KIT with magnetic beads; melatonin was measured by ELISA. In vitro exposure of the syncytiotrophoblast to H/R reduces the endogenous production of melatonin and induces a pro-inflammatory response by increased TNF, IL-6 and NFκB factors. In contrast, melatonin treatment increases IL-10 levels and restores TNF, IL-6 and NFκB levels. H/R also increases autophagy. Melatonin and a specific inhibitor of NFκB also lead to activation of autophagy and increased cell survival under H/R conditions. In BeWo cells, H/R with and without melatonin reduces cell viability and induces the activation of cellular energy sensors, which are upstream modulators of autophagy. H/R induces the autophagosome formation, autophagic activity, and induces Nrf2 transcription factor activity. In H/R conditions, melatonin reduced the activation of both autophagy and Nrf2, leading to the activation of apoptosis. In normal placental cells, H/R induces the activation of autophagy and Nrf2. Melatonin also increases their activity and consequently protects the cells against the deleterious effects of H/R. Since melatonin is involved in the regulation protective mechanisms of the human placenta, the actions of melatonin could improve the trophoblastic protection and sustain an optimal pregnancy and fetal development. Further studies are needed to optimize the effects of melatonin as possible prophylaxis or treatment for pregnancy diseases, such as preeclampsia.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Vaillancourt, Cathy
Mots-clés libres:	Mélatonine; Autophagie; Inflammation; Placenta; Trophoblaste villeux: Reproduction; Melatonin; Autophagy; Villous Trophoblast
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	25 août 2021 20:40
Dernière modification:	02 mars 2022 15:23
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/11904

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