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Inactivation des bactériophages M13 et MS2 par un laser femtoseconde.

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Berchtikou, Aziz (2020). Inactivation des bactériophages M13 et MS2 par un laser femtoseconde. Thèse. Québec, Doctorat en sciences de l'énergie et des matériaux, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, 160 p.

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Résumé

L’inactivation par le traitement laser femtoseconde est le résultat d’une succession complexe de mécanismes d’interaction entre l’impulsion laser et le matériau biologique. Notre étude s’inscrit dans le cadre de la compréhension des mécanismes d’inactivation des particules virales suite à un traitement laser femtoseconde. Les objectifs généraux, au départ, étaient de mettre en place une stratégie expérimentale dans le but d’améliorer l'inactivation des agents infectieux en optimisant les différents paramètres clefs régissant le procédé d’inactivation par le laser femtoseconde et de déterminer les phénomènes impliqués dans les mécanismes d’inactivation des bactériophages. À cette fin, les bactériophages M13 et MS2, deux agents infectieux très différents sur le plan biologique, sont exposés à des impulsions femtosecondes intenses dans le visible et le proche infrarouge. Dans un premier temps, nous avons étendu les travaux menés sur l’inactivation des virus par le traitement laser au moyen d’un système laser femtoseconde à technologie titane: saphir. On a accéléré l'inactivation des bactériophages par le laser à impulsions ultra-courtes rapportée (> 1 heure) à 15 min au maximum en grands volumes (1cm³). Pour raccourcir le temps d'exposition requis pour l'inactivation, nous avons utilisé des impulsions femtosecondes ultra-courtes (40 fs) et intenses (20 mJ) avec une cadence de 10 Hz. Avec ces paramètres, le temps d'exposition maximum requis pour l'échantillon est de 15 minutes, ce qui est considérablement plus court que celui utilise dans les précédentes études d'inactivation des virus au laser. L'efficacité de l'inactivation des agents infectieux par le traitement laser femtoseconde dépend de nombreux facteurs. Ces facteurs peuvent divisés en deux groupes: les paramètres laser femtoseconde (la durée d'impulsion, l'énergie d'irradiation, longueur d'onde d'excitation et la durée d'exposition) et les paramètres cibles (taille, structure de la capside et composition de génome viral,…). Tous ces facteurs affectent les différentes étapes de l’inactivation des pathogènes. La fonctionnalité des bactériophages M13 et MS2 est montrée être dépendante de la densité d'énergie du laser d'excitation ainsi que du temps d'exposition. La diminution de la densité d'énergie d’irradiation semble réduire l'efficacité de l'inactivation des virus. L’augmentation du temps d’exposition induit une destruction progressive des particules. L'inactivation du virus s'est avérée très sensible à la durée de l'impulsion laser. L'inactivation est maximale lorsque la durée de l'impulsion est courte et diminue progressivement à mesure que la durée de l'impulsion du laser d'excitation augmente à densité de puissance laser constante (17 GW cm⁻ ²) et à la longueur d'onde d'excitation. En outre, l'inactivation du virus s'est avérée dépendre de la longueur d'onde d'excitation. Pour des temps d'exposition courts, les deuxièmes harmoniques du laser Ti:saphir ont montré une efficacité d'inactivation plus élevée que les longueurs d'onde fondamentales. Enfin, l’efficacité de ce traitement laser femtoseconde dépend également de la sensibilité de l’agent infectieux ciblé. Les M13 et MS2, deux agents infectieux très différents sur le plan biologique ont montré des comportements d’inactivation très différents au traitement laser à 400 nm. Les différences des comportements ne peuvent être rationalisées que si les mécanismes moléculaires induisant l’inactivation sont compris. Nous avons par conséquent déterminé comment des différences dans la composition du génome et des protéines virales peuvent avoir un impact sur les mécanismes d’inactivation des bactériophages par le traitement laser. Des études récentes soulignent que l’inactivation virale observée lors d’un traitement laser serait liée à des modifications au niveau de la capside des virus. La surface de la capside est ainsi le siège de réactions physico-chimiques liées au milieu qui peuvent altérer le caractère infectieux et en particulier la capacité du virus à reconnaître sa cellule hôte. C’est pourquoi nous avons étudié l’inactivation et l’évaluation des propriétés de surface de nos deux virus modèles au cours de ces traitements. Cette étude a pour but de mieux comprendre les processus de l’inactivation et de la dégradation des particules virales au cours d’un traitement technologique. L’étude des modifications physico-chimiques au cours de l’inactivation virale nous a souligné que les propriétés interfaciales sont différentes entre le phage MS2 et le phage M13. Ces résultats démontrent donc qu’il est possible de préciser les mécanismes responsables de la baisse des UFP. Ces résultats suggèrent que l'altération de la structure de la protéine de la capside virale due à l'agrégation des protéines est la cause d'inactivation de MS2 traitées au laser. Les vibrations induites par le traitement laser femtoseconde provoquent une perturbation transitoire des liaisons relativement faibles à l’intérieur d’une capside viral. Cela conduit par conséquence à un dépliement partiel des protéines virales en perturbant les liaisons hydrogène et / ou les interactions hydrophobes, conduisant à l'agrégation de protéines virales étroitement associées et à l'inactivation du virus. D'autre part, pour les bactériophages M13, des travaux antérieurs ont examiné les mécanismes d'inactivation du phage par le traitement laser femtoseconde. Ils ont démontré que l'inactivation des M13 est lié à la détérioration de leur capside protéique virale. Ce travail de recherche s’est déroulé au laboratoire ALLS de l’Institut National de la Recherche Scientifique (INRS) -Centre Énergie Matériaux Télécommunications (EMT) en collaboration avec le groupe de professeur Peter Tijssen du Centre INRS–Institut Armand-Frappier et le groupe de professeur Marc A. Gauthier (EMT). Cette thèse présente un fort caractère expérimental, beaucoup de temps a été accordé pour effectuer les expériences, évaluer et trier les données obtenues. Ce document articulé en six chapitres présente les résultats obtenus au cours de ces cinq années d’étude. Le premier chapitre dédie à l’étude bibliographique qui précise le contexte général de notre étude, en présentant les principes de ces différentes méthodes actuelles d’inactivation, mais également les limites qu'elles peuvent présenter, et la nouvelle technologie innovante d’inactivation, la décontamination par le traitement laser femtoseconde qui présentent une alternative séduisante. Nous développons pourquoi cette technologie se distingue des autres, et quelle pourrait être sa place dans le secteur industriel actuel. Le deuxième chapitre présente d'importantes applications biomédicales de l’inactivation par le laser femtoseconde pour la prévention des maladies infectieuses par la réduction des composants pathogènes du sang, la stérilisation des produits pharmaceutiques et biologiques, la décontamination des cultures cellulaires et la production de vaccins sûrs et efficaces. Le troisième chapitre donne une description succincte de mécanisme possible d’inactivation par le traitement laser femtoseconde. Dans cette section, le principe d'ISRS et son effet sur un système de agents infectieux (virus) sont introduits de manière concise. Le quatrième chapitre présente les dispositifs expérimentaux et les matériaux utilisés ainsi que les diverses méthodes mises en œuvre au cours de cette étude pour préparer une suspension du stock phagique isolés stable au cours du temps. Dans la première partie, nous ne donnons que les grandes lignes d’obtention de stock de bactériophages et culture de la bactérie nécessaire pour le titrage et les méthodes qui ont permis la caractérisation de cette suspension stock de même que les suspensions de phages obtenues après le traitement laser. Ensuite la seconde partie est consacrée à l’appareillage expérimental utilisé dans nos travaux. Nous donnons une description brève des éléments clés de ces dispositifs expérimentaux: la source laser femtoseconde et le montage expérimental. Ensuite, les résultats obtenus sont présentés et analysés dans le cinquième chapitre. Dans ce chapitre, nous montrons que l'efficacité de l'inactivation des agents infectieux par le laser femtoseconde dépend de nombreux facteurs. Ces facteurs peuvent être divisés en deux groupes: les paramètres de source laser femtoseconde (tels que la longueur d'onde, le temps d'exposition à l'irradiation et l'énergie et la largeur d'impulsion) et les paramètres cibles (taille biologique, composition du génome viral). Tous ces facteurs affectent les différentes étapes de l’inactivation des agents infectieux. Dans le sixième et dernier chapitre, des conclusions globales ainsi que des perspectives soulevées par ces travaux sont finalement formulées.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Ozaki, Tsuneyuki
Mots-clés libres: énergie; matériaux
Centre: Centre Énergie Matériaux Télécommunications
Date de dépôt: 14 oct. 2020 19:23
Dernière modification: 14 oct. 2020 19:23
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/10394

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