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Caractérisation moléculaire du virus de la mosaïque du navet

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Nicolas, Olivier (1993). Caractérisation moléculaire du virus de la mosaïque du navet Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 184 p.

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Résumé

Le virus de la mosaïque du navet (TuMV) est un virus phyto-pathogène extrêmement important. En effet, ce virus infecte un très grand nombre d'espèces appartenant principalement à la famille des crucifères, dont beaucoup sont d'importance économique; ce virus est également présent sur tous les continents. Au Québec et en Ontario, le TuMV est responsable d'une maladie grave affectant principalement le rutabaga (Brassica napus ssp. napobrassica).

Le TuMV appartient au groupe des potyvirus, qui est le plus important parmi ceux des virus de plantes. ll a un génome composé d'un unique ARN d'environ 10 000 bases, polyadénylé en 3', et qui possède une protéine (VPg) liée de façon covalente en 5'. Son virion a une forme de bâtonnet flexueux composé d'environ 2 000 copies de la protéine structurale principale qui est la protéine de la capside (CP).

Dans l'objectif d'une caractérisation moléculaire du TuMV, et afin de pouvoir intégrer nos résultats à la compréhension des mécanismes moléculaires qui conduisent à la multiplication et la propagation des potyvirus, nous avons entrepris de cloner et de séquencer son génome. Nous avons utilisé une nouvelle stratégie pour amplifier et cloner l'ARN du TuMV. Celle-ci a consisté à l'amplification des premiers brins d'ADNe du TuMV par polymérisation en chaîne (PCR) avec l'ADN polymérase thermostable de Thermus aquaticus (Taq polymérase). Les produits d'amplification par PCR ont été clonés sans ligation dans le vecteur pUC9 dans une première étape, puis dans une deuxième étape, par ligation dans le vecteur pUC19, grâce à des sites de restriction introduits au cours de l'amplification. Certaines amorces spécifiques provenaient de la séquence réelle du TuMV alors que d'autres, dégénérées, provenaient d'homologies de séquence parmi quatre potyvirus séquencés. Le génome du TuMV a pu être ainsi cloné au complet grâce à sept amplifications successives par PCR. La séquence de l'extrémité 5' de l'ARN a été confirmée par une réaction d'extension d'amorce («primer extension»).

Les séquences provenant des différents clones d'amplification ont été alignées et 1 'ARN du TuMV présente les caractéristiques suivantes: il possède un ARN de 9 163 bases suivies d'une queue polyadénylée d'au moins 55 résidus; cet ARN comporte une séquence 5' non-codante de 129 nucléotides (nt) suivie d'une séquence codant pour une polyprotéine de 3 163 acides aminés et d'une séquence 3'-NC de 212 nt. La polyprotéine a été analysée et neuf sites de clivage reconnus par les trois protéases virales ont été localisés. La protéine de la capside a été séquencée à son extrémité aminée, ce qui a permis de localiser le premier site de clivage par la protéase Nia. Nous avons trouvé six autres sites potentiels de clivage par la Nia dont un, à l'intérieur même de la Nia, a été démontré chez E. coli. Ce site interne et celui situé en N-terminal de la Nia sont légèrement différents des autres du fait qu'en position -1 de la liaison peptidique hydrolysée, se trouve un acide glutamique plutôt qu'une glutamine. Les sites de clivage par les protéases Pl et HC ont également été localisés sur la polyprotéine. Les dix protéines potentielles pouvant donc être libérées après protéolyse par les trois protéases virales ont été analysées et quelques hypothèses ont été élaborées quant à leur rôle probable sur la multiplication ou la propagation du virus.

Nous avons également construit un clone complet d'ADN du TuMV en aval d'un promoteur d'origine phagique. Ceci était une des étapes importantes conduisant à l'obtention d'un clone infectieux, c'est-à-dire d'un clone capable d'induire une infection du même type que celle obtenue avec 1' ARN viral natif. La maîtrise des transcrits infectieux est un atout important pour l'étude moléculaire d'un virus tel que le TuMV car cela permet d'introduire des mutations sur l' ARN tout en conservant son caractère infectieux. Des transcrits synthétiques pratiquement identiques à 1 'ARN viral, mais comportant en 5' un analogue de coiffe méthylée, ont été synthétisés in vitro. Ces transcrits ont été testés par inoculation mécanique de deux espèces sensibles au TuMV.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Laliberté, Jean-François
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 20 nov. 2019 15:32
Dernière modification: 20 nov. 2019 15:32
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/8664

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