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Revue des procédés de déconjugaison des stéroïdes urinaires et optimisation d'une méthode de solvolyse des sulfates

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Amireault, Catherine (2019). Revue des procédés de déconjugaison des stéroïdes urinaires et optimisation d'une méthode de solvolyse des sulfates Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 91 p.

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Résumé

Lors de contrôles antidopage, les stéroïdes anabolisants androgènes et leurs métabolites majoritairement glucuroconjugués sont principalement analysés et détectés par les méthodes de chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Grâce aux standards disponibles, ces molécules sont identifiables dans le cas d’un dopage sportif grâce à leur temps de rétention et leur spectre de masse. Cependant, depuis les dix dernières années, un vent de changement souffle sur les méthodes d’identification de composés dopants puisque les chercheurs tentent de trouver de nouveaux métabolites permettant d’augmenter la période de détection. Parmi ceux-ci, les métabolites sulfoconjugués, qui ont longtemps été laissés de côté, seraient une façon prometteuse de détecter des cas de dopage. Selon plusieurs études récentes, ces sulfates sont excrétés plus longtemps par le corps humain et donc, constitueraient de bonnes cibles pour une rétrospection à long terme concernant la détection de la prise de stéroïdes.

Bien que différentes méthodes de déconjugaison soient proposées dans la littérature pour l’extraction de ces composés à partir de l’urine, aucune n’est optimale. Il faudrait une méthode spécifique et sélective qui ne crée pas de produit secondaire. Elle devrait aussi posséder un bon taux de recouvrement des composés désirés tout en étant simple d’usage pour une application de routine dans les laboratoires de contrôle du dopage. Des travaux préliminaires dans notre laboratoire ont montré la présence de réactions secondaires indésirables dans les conditions classiques de solvolyse chimique alors que l’hydrolyse des sulfates de plusieurs stéroïdes urinaires résistait à l’emploi d’arylsulfatases commerciales. Une revue des principales méthodes s’imposait.

Lors de la réalisation des présents travaux de recherche, nous avons évalué la performance de plusieurs méthodes d’hydrolyse, qu’elles soient enzymatiques ou chimiques. Des préparations d’enzymes issues d’Escherichia coli ou d’Helix pomatia ont été testées selon différentes conditions d’utilisation. Les résultats les plus prometteurs sont obtenus avec les différents types de β-glucuronidases d’E. coli comme le type 1X-A, le type K-12 ou celle recombinante. Un autre procédé de déconjugaison encore bien souvent utilisé aujourd’hui, soit la solvolyse chimique avec l’acétate d’éthyle, a aussi été comparé avec l’utilisation du tétrahydrofurane comme solvant alternatif. Les résultats sont clairs : l’utilisation de l’acétate d’éthyle n’est pas recommandée. Une méthode optimisée de solvolyse avec le tétrahydrofurane acidifié est donc proposée.

Une importante mise à jour des méthodes de déconjugaison des métabolites sulfoconjugués de stéroïdes anabolisants a été effectuée. Avec ces travaux, les spécialistes des laboratoires de contrôle du dopage pourront prendre des décisions éclairées lors de la réalisation d’une déconjugaison de métabolites urinaires glucuroconjugués ou sulfoconjugués. Dans un avenir proche, il appartiendra alors aux organismes régulant le dopage sportif de déterminer quelle place ces métabolites sulfoconjugués occuperont lors des tests d’antidopage et s’ils peuvent vraiment permettre un meilleur diagnostic de la prise de stéroïdes anabolisants avec une plus grande rétrospection.

Abstract

Nowadays, when performing anti-doping tests, anabolic-androgenic steroids are mainly analyzed by their glucuronide metabolites detected by gas chromatography-tandem mass spectrometry. With many standards available, these compounds can be easily identified in sports doping cases thanks to their retention time and their mass spectrum. However, in the last ten years, we’ve been seeing a lot of changes that happened on the identification of doping compounds since researchers are constantly trying to find new metabolites to increase the detection period. Among these, the sulphoconjugates, which have been left out for a long time, would be a promising way of detecting doping cases. According to several recent studies, these sulphates metabolites are excreted on a longer period by the human body and therefore would be good targets for a long-term retrospection regarding the detection of steroid intake.

Although different methods of deconjugation are proposed in the literature for the extraction of these compounds from urine, none are optimal. Therefore, it would require a specific and selective method that does not allow the creation of secondary products. It should also have a good recovery rate of desired compounds while being easy to use for routine application in doping control laboratories. Preliminary work in our laboratory has shown the presence of undesirable side reactions under standard conditions of chemical solvolysis while hydrolysis of the sulphates of several urinary steroids resisted the use of commercial arylsulphatases. A review of the main methods is needed.

In the present research, the performance of several hydrolysis methods, whether enzymatic or chemical, has been evaluated. Enzymes preparations from Escherichia coli or Helix pomatia have been tested under different conditions of use. The most promising results were obtained with various types of β-glucuronidases from E. coli such as 1X-A and K-12 or from recombinant source. Also, another deconjugation method widely used today, the chemical solvolysis with ethyl acetate, has also been compared with the use of tetrahydrofuran as an alternative solvent. The results are clear: the use of ethyl acetate is not recommended during such experiments. An optimized method of solvolysis with tetrahydrofuran is therefore proposed.

An important update of the deconjugation methods of sulphoconjugates metabolites of anabolic steroids has been carried out. With this work, doping control laboratory specialists will be able to make informed decisions when performing a deconjugation of glucuronides or sulphoconjugates urinary metabolites. Henceforth, it will be up to the regulating sports doping officials to determine which place these sulphoconjugated metabolites will occupy in anti-doping tests and whether they can really allow a better diagnosis of the use of anabolic steroids with greater retrospection then before.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Ayotte, Christiane
Mots-clés libres: CG-SM/SM; solvolyse; métabolites sulfoconjugués; tétrahydrofurane; hydrolyse; enzymes; GC-MS/MS; solvolysis; sulphate metabolites; tetrahydrofuran; hydrolysis; enzymes
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 20 nov. 2019 21:35
Dernière modification: 20 nov. 2019 21:35
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/8520

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