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Diindolylmethane (DIM) and Ring-Substitued Halogenated Derivatives of DIM (Ring-DIMS): Their Role in Prostate Cancer Prevention

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Draz, Hossam (2019). Diindolylmethane (DIM) and Ring-Substitued Halogenated Derivatives of DIM (Ring-DIMS): Their Role in Prostate Cancer Prevention Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 195 p.

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Résumé

Cette étude a pour objectif d'examiner les propriétés antiprolifératives du un dérivé de légumes crucifères; le diindolylméthane (DIM), ainsi que certains de ces dérivés synthétiques (ring-DIMs) dans des cellules cancéreuses humaines de la prostate androgènes-dépendantes (AD) et androgènes-indépendants (AI). Ces cellules ont été utilisées pour étudier plusieurs mécanismes moléculaires de l'action anticancéreuse des ring-DIMs. Par ailleurs, des souris porteuses de tumeurs cancéreuses humaines de la prostate bioluminescentes ont été utilisées pour évaluer l'activité anticancéreuse de ring-DIMs in vivo, en utilisant une technique d'imagerie non invasive et en temps réel.

En effet, le DIM est un métabolite de l'indole-3-carbinol (I3C), un composant important des légumes crucifères de la famille des Brassica, tels que le brocoli et les choux de Bruxelles. Selon les études épidémiologiques, la consommation élevée de ces légumes est associée à une réduction des risques du développement de divers cancers. L'I3C et le DIM sont capables d’inhiber la croissance de diverses cellules cancéreuses in vitro ainsi qu’in vivo incluant le cancer de la prostate, le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez l'homme occidental. Le DIM inhibe la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques AD (LNCaP) qui est stimulée préalablement par la dihydrotestostérone (DHT). De plus, le DIM induit l'apoptose cellulaire et inhibe la croissance des tumeurs de la prostate in vivo. Dans ce même contexte, nos études antérieures ont montré que le DIM et les ring-DIMs diminuent l'expression génique des récepteurs aux androgènes (AR), réduisent les taux de protéine AR et l'expression de l'antigène prostatique spécifique (PSA) médiée par l'AR. Les ring-DIMs disubstitués par des halogènes (Br2 ou Cl2) en positions 4- et 4'- de la molécule DIM bloquent l'accumulation de l'AR dans le noyau des cellules LNCaP stimulées par la DHT. Cependant, nos connaissances concernant la capacité du DIM et ses dérivés à affecter les mécanismes de protection cellulaire tels que l'autophagie ou le stress du réticulum endoplasmique (ER) sont faibles. Les ring-DIMs ont été décrits à agir comme des inhibiteurs de la prolifération des cellules tumorales plus puissants que DIM. En effet, ils sont efficaces contre les cellules cancéreuses de la prostate hormono-dépendantes, ainsi qu’indépendantes. De ce fait, ils ont un potentiel supplémentaire pour le traitement du cancer de la prostate résistant au traitement par les antiandrogènes. Dans la recherche sur de nouveaux médicaments efficaces contre le cancer de la prostate et l'hyperplasie bénigne de la prostate, ces composés seraient d'excellents candidats pour des études actives sur leurs mécanismes d'action moléculaires et leurs activités biologiques in vivo.

Ainsi, notre hypothèse de travail est que les ring-DIMs possèdent des activités anticancéreuses prostatiques et qu'ils sont plus puissants que le DIM. Cela dans le but de développer des médicaments efficaces dans le traitement du cancer de la prostate. Le premier objectif de recherche était de déterminer les événements précoces entraînant la mort cellulaire induite par DIM et les ring-DIMs. Nous avons étudié leurs effets sur la stabilité mitochondriale, le stress du ER et l'autophagie en fonction de la concentration et le temps d’exposition. Nous avons ainsi démontré que le DIM et les ring-DIMs induisent la mort des cellules cancéreuses de la prostate LNCaP (AR-positives et AD), C4-2B (AR-positives et AI) et DU145 (AR-négatives, AI et déficientes à l'autophagie), contrairement à leur manque de toxicité chez les cellules épithéliales humaines de la prostate normales immortalisées (RWPE-1). Nous montrons également que les ring-DIMs causent la perte précoce du potentiel de la membrane mitochondriale et la diminution de la production mitochondriale d'ATP dans les cellules cancéreuses de la prostate. Nos observations mettent en évidence une perturbation de la fonction mitochondriale en tant qu'événement déterminant dans les actions cytotoxiques du DIM et tous les ring-DIMs. Cependant, le salubrinal, un inhibiteur du stress ER, inhibait seulement la mort cellulaire médiée par les 4,4'-dihaloDIMs, en revanche, le salubrinal exacerbait la toxicité des 7,7'-dihaloDIMs. En utilisant une analyse in silico de l'affinité par docking en 3-D, nous avons identifié la calmoduline-kinase II dépendante du Ca+2 (CaMKII) en tant que cible potentielle pour le ring-DIM le plus toxique, le 4,4'-dibromoDIM. Nos résultats ont montré que l'inhibiteur de CaMKII (KN93) abrogait complètement la toxicité de ce ring-DIM, mais pas la toxicité du 7,7'-Cl2DIM. L'implication des pores de transition de perméabilité mitochondriale dans la toxicité des ring-DIMs est suggérée par un traitement avec la cyclosporine A (inhibitrice des pores de transition de perméabilité mitochondriale), qui abrogait la toxicité de tous les ring-DIMs, mais pas cela du DIM. L'un des principaux résultats de cette étude était que le DIM et les ring-DIMs induisaient l'autophagie dans les cellules cancéreuses de la prostate. L'inhibition de l'autophagie avec la bafilomycine A1, la 3-méthyladénine ou par le silençage génique de LC3B sensibilisait les cellules LNCaP et C4-2B, mais pas les cellules DU145 déficientes en ATG5 à la mort cellulaire induite par le DIM et les ring-DIMs. Nous proposons que l'autophagie induite par le DIM et les ring-DIMs ait une fonction cytoprotectrice dans les cellules cancéreuses de la prostate.

Notre deuxième objectif de recherche était d'étudier les effets mécanistiques des ring-DIMs sur les voies de signalisation impliquées dans la mort cellulaire des cellules cancéreuses de la prostate. Nous avons trouvé que l'autophagie induite par le DIM et les ring-DIMs s'accompagnait d'une augmentation de la formation des vacuoles autophagiques et de la conversion de LC3BI en LC3BII dans les cellules cancéreuses humaines de la prostate LNCaP et C4-2B. Le DIM et les ring-DIMs induisaient également la phosphorylation de l'AMPK (protéine kinase activée par l'AMP), de l'ULK-1 (kinase d'activation de l'autophagie de type unc-51 type 1, ATG1) et de l'acétyl-CoA carboxylase (ACC). De plus, le DIM et les ring-DIMs induisaient le gène 1 des protéines astrocytaires (AEG-1). La régulation à la baisse d'AEG-1 ou d'AMPK inhibe l'autophagie induite par le DIM et le ring-DIMs. Un prétraitement avec des siRNA d'AEG-1 ou AMPK potentialisait la cytotoxicité du DIM et des ring-DIMs. Également, la régulation à la baisse d'AEG-1 induisait la sénescence dans des cellules traitées avec des concentrations de DIM ou ring-DIMs ouvertement cytotoxiques et inhibait l'initiation de l'apoptose en réponse à ces composés. En effet, nous avons identifié un nouveau mécanisme pour l'autophagie protectrice induite par le DIM et les ring-DIMs via l'induction de l'AEG-1 et l'activation subséquente de l'AMPK.

Notre troisième objectif de recherche était d'étudier l'effet de DIM et le ring-DIM le plus puissant (4,4'-Br2DIM) sur le développement tumoral dans un modèle de xénogreffe murine du cancer de la prostate humaine. L'utilisation de cellules PC-3 bioluminescentes pour surveiller la croissance tumorale et les effets du traitement chimique avec les nouveaux ring-DIMs constitute l'un des principaux aspects novateurs de la présente étude. La surveillance in vivo en temps réel réduit le nombre d'animaux requis pour les expériences proposées, car ce n'est pas nécessaire de sacrifier les souris à des intervalles pendant la progression de la tumeur. Nous avons trouvé que l'inhibition de l'autophagie par la chloroquine (CQ) sensibilisait significativement les cellules PC-3 à la mort en présence de concentrations du DIM ou 4,4'-Br2DIM qui étaient sous-toxiques in vitro. De plus, une combinaison de DIM (10 mg/kg) et CQ (60 mg/kg), 3x par semaine, réduisait significativement la croissance des tumeurs PC-3 in vivo après 3 et 4 semaines de traitement. De plus, le 4,4'-Br2DIM (10 mg/kg, 3x par semaine) inhibait significativement la croissance tumorale après 4 semaines de traitement. L'analyse de micromatrices tissulaires préparer à partir des tumeurs excisées a montré que le DIM seul ou en co-traitement avec la CQ induisait le marqueur d'apoptose TUNEL, et inhibait significativement le marqueur de prolifération cellulaire Ki67.

En conclusion, nos résultats de recherche fournissent des informations importantes sur les mécanismes d'action potentiels du DIM et les ring-DIMs qui ont des activités biologiques divergentes de DIM. Nous avons également identifié un nouveau mécanisme pour l'autophagie protectrice médiée par le DIM et les ring-DIMs via l'activation de l'AMPK et l'induction de l'AEG-1. De plus, nos découvertes pourrait faciliter le développement de nouvelles pharmacothérapies contre le cancer de la prostate qui comprennent des inhibiteurs sélectifs de l'autophagie en tant qu'adjuvants.

Abstract

The objective of this research study is to investigate the antiproliferative properties of the cruciferous vegetable-derived compound diindolylmethane (DIM), and several synthetic disubstituted halogenated DIM-derivatives (ring-DIMs) in androgen-dependent (AD) and androgen-independent (AI) human prostate cancer cells. We aimed to investigate several molecular mechanisms of anticancer action of the ring-DIMs in vitro. In addition, mice carrying bioluminescent human prostate cancer tumors were used to assess the anticancer activity of these compounds in vivo, using a non-invasive, real-time imaging technique.

DIM is formed as a metabolite of indole-3-carbinol (I3C), an important component of cruciferous vegetables of the Brassica family, such as broccoli and Brussels sprouts. Epidemiological studies show that high consumption of these vegetables is associated with decreased risks of various cancers. Both I3C and DIM inhibit the growth of various cancers in vitro and in vivo, including cancer of the prostate, which is the most common malignancy in Western men. DIM also inhibits dihydrotestosterone (DHT)-mediated proliferation of the AD LNCaP prostate cancer cells, induces apoptosis, and inhibits prostate tumor growth in vivo. Our previous studies show that DIM and ring-DIMs down-regulate androgen receptor (AR) expression; reduce AR protein levels and AR-mediated prostate specific antigen (PSA) expression. In addition, 4,4'-dihalo-substituted ring-DIMs, block accumulation of AR in the nucleus of androgen-stimulated LNCaP cells. Less is known about the ability of DIM or its derivatives to affect cell protective mechanisms such as autophagy and endoplasmic reticulum (ER) stress. Further results show that ring-DIMs are considerably more potent inhibitors of tumor cell proliferation than DIM, and are effective against hormone-dependent, as well as -independent prostate cancer cells, indicating their additional potential in the treatment of androgen-refractory prostate cancer. In the quest for novel drugs effective against prostate cancer and benign prostate hyperplasia these compounds are excellent candidates for detailed research concerning their molecular mechanisms of action and biological activity in vivo.

Our working hypothesis is that ring-DIMs exhibit anti-prostate cancer activities and are considerably more potent than DIM. Thus making them suitable candidates for development as drugs effective in the treatment of prostate cancer. Our first research objective was to determine the early events that result in cell death induced by DIM and ring-DIMs by determining their concentration- and time-dependent effects on mitochondrial stability, ER stress and autophagy. We demonstrated that DIM and ring-DIMs induced the death of LNCaP (AR-positives and AD), C4-2B (AR-positives and AI) and DU145 (AR-negatives, AI and autophagy deficient) prostate cancer cells, but not that of immortalized normal human prostate epithelial (RWPE-1) cells. We also showed that ring-DIMs caused the early loss of mitochondrial membrane potential (MMP) and decreased mitochondrial ATP generation in prostate cancer cells. Our evidence points at disruption of mitochondrial function as the defining event in the cytotoxic actions of all ring-DIMs. However, salubrinal, an inhibitor of ER stress, inhibited cell death mediated only by 4,4’-dihaloDIMs by contrast, it exacerbated the toxicity of the 7,7'-dihaloDIMs. Using in silico 3-D docking affinity analysis, we identified Ca+2/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII) as a potential direct target for the most toxic ring-DIM, 4,4’-dibromoDIM. Our results showed that CaMKII inhibitor KN93 completely abrogatated the toxicity of this ring-DIM, but not the toxicity of 7,7'-Cl2DIM. Involvement of the mitochondrial permeability transition pore in the toxicity of ring-DIMs is suggested by treatment with the mitochondrial permeability transition pore-inhibitor cyclosporin A, which abrogatated the toxicity of all ring-DIMs, although not that of DIM. One of the main findings of the current study was that DIM and ring-DIMs induced autophagy in prostate cancer cells. Inhibition of autophagy with bafilomycin A1, 3-methyladenine or by LC3B gene silencing sensitized LNCaP and C4-2B, but not ATG5-deficient DU145 cells to ring-DIM- and DIM-mediated cell death. We propose that autophagy induced by DIM and ring-DIMs has a cytoprotective function in prostate cancer cells.

Our second research objective was to study the mechanistic effects of ring-DIMs on signalling pathways involved in prostate cancer cell death. We found that DIM- and ring-DIM-induced autophagy was accompanied by increased autophagic vacuole formation and conversion of LC3BI to LC3BII in LNCaP and C4-2B human prostate cancer cells. DIM and ring-DIMs also induced the phosphorylation of AMP-activated protein kinase (AMPK), ULK-1 (unc-51-like autophagy activating kinase 1; ATG1) and acetyl-CoA carboxylase (ACC). Interestingly, DIM and ring-DIMs induced the oncogenic protein astrocyte-elevated gene 1 (AEG-1). Downregulation of AEG-1 or AMPK inhibited DIM and ring-DIM-induced autophagy. Pretreatment with either AEG-1 or AMPK siRNAs potentiated the cytotoxicity of DIM and ring-DIMs. Interestingly, downregulation of AEG-1 induced senescence in cells treated with overtly cytotoxic concentrations of DIM or ring-DIMs and inhibited the onset of apoptosis in response to these compounds. Indeed, we have identified a novel mechanism for DIM- and ring-DIM-induced protective autophagy, via induction of AEG-1 and subsequent activation of AMPK.

Our third research objective was to study the effect of DIM and the most potent ring-DIM (4,4'-Br2DIM) on tumor development in a murine xenograft model of human prostate cancer. The use of bioluminescent PC-3 cells to monitor tumor growth and the effects of chemical treatment with the new ring-DIMs is one of the novel aspects of this study. The real-time monitoring of tumor growth in vivo reduces the number of animals required for the proposed experiments, since they do not have to be sacrificed at intervals during tumor progression. We found that the autophagy inhibitor chloroquine (CQ) significantly sensitized PC-3 cells to death in the presence of concentrations of DIM or 4,4'-Br2DIM that were sub-toxic in vitro. Moreover, a combination of DIM (10 mg/kg) and CQ (60 mg/kg), 3 x per week, significantly decreased PC-3 tumor growth in vivo after 3 and 4 weeks of treatment. Furthermore, 4,4'-Br2DIM at 10 mg/kg (3 x per week) significantly inhibited tumor growth after 4 weeks of treatment. Tissues microarray analysis of excised tumors showed that DIM alone or combined with CQ induced apoptosis marker TUNEL, and significantly inhibited the cell proliferation marker Ki67.

Taken together, our research findings provide important information on the potential mechanisms of action of DIM and the ring-DIMs, which have divergent biological activities from DIM. We also identified a novel mechanism for DIM and ring-DIMs mediated protective autophagy via the activation of AMPK and induction of AEG-1. Moreover, our findings may facilitate the development of novel drug therapies against prostate cancer that include selective autophagy inhibitors as adjuvants.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Sanderson, Thomas
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 21 nov. 2019 16:35
Dernière modification: 21 nov. 2019 16:35
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/8516

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