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Étude des mécanismes d’approvisionnement des précurseurs lipidiques des rhamnolipides et caractérisation mutationnelle de l’enzyme RhlA de Pseudomonas aeruginosa.

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Dulcey Jordan, Carlos Eduardo (2019). Étude des mécanismes d’approvisionnement des précurseurs lipidiques des rhamnolipides et caractérisation mutationnelle de l’enzyme RhlA de Pseudomonas aeruginosa. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 218 p.

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Résumé

Les composés surfactants présentent un intérêt industriel élevé dans la société moderne étant donné les nombreuses applications qui en découlent. En effet, considérant les applications variées des surfactants dans les domaines pharmaceutiques, alimentaires, cosmétiques, textiles, agricoles, de la papeterie, pétroliers et des produits ménagers, entre autres, il est facile d’imaginer la panoplie d’utilisations possibles de ces composés dans une myriade de produits de consommation quotidienne. Sans équivoque, vu les multiples utilisations possibles des surfactants et grâce à leur versatilité, l’industrie pour ces composés bénéficie d’un marché mondial de plusieurs milliards de dollars. Ce marché est bien consolidé et en croissance en raison de l’augmentation de l’industrialisation dans les pays du tiers monde, de la diversification des produits, de l’amélioration générale du niveau de vie dans plusieurs pays et de la croissance continue de la population mondiale. À la demande mondiale des surfactants, s’ajoute le fait que la production de ces composés consomme également de très grandes quantités de matières premières pétrochimiques et de graisses naturelles. Par ailleurs, l’utilisation massive de surfactants dans les produits domestiques comme les détergents et les cosmétiques, et leur dispersion subséquente dans les systèmes aquatiques, sont des raisons qui plaident fortement en faveur du remplacement des surfactants synthétiques conventionnels par des composés plus écologiques. Cette transition implique, notamment, le développement de molécules plus facilement biodégradables et moins toxiques. D’autre part, les raisons qui justifient la recherche de surfactants de remplacement ne sont pas seulement environnementales. En effet, les prévisions de consommation soulèvent aussi des préoccupations d’ordre économique étant donné que la concurrence entre les différents secteurs d’utilisation des hydrocarbures s’intensifie et que l’approvisionnement en ressources pétrolières brutes devient de plus en plus difficile. De nouvelles recherches s’orientent donc peu à peu vers l’étude de molécules d’origine microbienne de faible toxicité; ces molécules présenteraient des propriétés surfactives comparables tout en permettant d’obtenir des produits plus respectueux de l‘environnement d’une qualité égale ou supérieure aux surfactants conventionnels. Il s‘agit somme toute de recherches complexes qui sont encore dans leurs premiers balbutiements et donc dans des stades de développement préliminaires.

La production industrielle de surfactants microbiens constitue donc une alternative pour favoriser le développement durable au sein d’une société globalisée qui fait face aux défis des changements climatiques et de la diminution de la biodiversité, ainsi qu’aux défis reliés à l’insécurité alimentaire et énergétique au niveau mondial.

Depuis la découverte des rhamnolipides en 1946, ces composés d’origine bactérienne sont devenus un sujet de recherche et de nombreuses études leurs sont consacrées. Ces recherches visent notamment la caractérisation de leur structure, leur diversité, leur biosynthèse, leurs propriétés physicochimiques, leur production industrielle et leurs applications potentielles. Toutefois, en dépit de leurs excellentes propriétés comme agents surfactants et leur innocuité pour l’homme et l’environnement, les rhamnolipides ne représentent à l’heure actuelle qu’une faible part du marché global de surfactants. En effet, la convergence de plusieurs facteurs est déterminante dans le coût de production élevé de ces glycolipides, ce qui demeure le principal élément limitant leur utilisation à grande échelle. Ces facteurs incluent aussi les coûts des matières premières et la faible productivité cellulaire. L’optimisation de ces facteurs est d’une grande importance pour diminuer les coûts globaux et accroitre la disponibilité de ces biosurfactants à des coûts compétitifs.

En tant que biologiste, je m’intéresse au potentiel du génie métabolique et du génie des protéines pour augmenter le rendement de production des rhamnolipides est attrayant. Cependant, les mécanismes métaboliques impliqués dans leur production chez les bactéries restent encore mal compris, limitant ainsi la mise en place de stratégies d’optimisation efficaces. Par ailleurs, le manque de caractérisation structurale des enzymes impliquées limite l’emploi d’approches par génie des protéines, telle l’optimisation rationnelle de ces enzymes.

L’objectif principal de cette thèse est d’accroître les connaissances pour atteindre une meilleure compréhension du mécanisme de biosynthèse du précurseur lipidique des rhamnolipides, ce qui pourrait faciliter la conception de nouvelles approches permettant de diriger le flux de carbone vers la synthèse de ces glycolipides. Le sujet est abordé du point de vue métabolique (le mécanisme d’approvisionnement des acides gras) et du point de vue protéomique (identification de motifs nécessaires à la reconnaissance du substrat par RhlA, une enzyme clé dans la synthèse du précurseur lipidique des rhamnolipides chez les bactéries Pseudomonas et Burkholderia).

Le premier chapitre présente une brève introduction au sujet des rhamnolipides. Cette revue de littérature inclut différents aspects généraux comme leur découverte, leur diversité structurale, les microorganismes producteurs, leurs fonctions biologiques, leurs propriétés surfactives et les applications potentielles dans les procédés industriels et dans les produits de consommation quotidienne.

Le deuxième chapitre aborde la problématique des mécanismes distincts proposés pour la canalisation des acides gras vers la biosynthèse de rhamnolipides. Dans ce chapitre, deux modèles, qui sont sujets à controverse, sur l’implication de la β- oxydation dans la biosynthèse des rhamnolipides ont été étudiés, soient les modèles proposés par Zhang et al. (2012) et Abdel-Mawgoud et al. (2014). Les résultats présentés dans ce chapitre apportent des évidences supportant le modèle postulé par Abdel-Mawgoud et al. (2014) selon lequel un intermédiaire de la β- oxydation ayant une chaîne aliphatique de dix carbones est dirigé vers la synthèse de rhamnolipides. Cependant, le mécanisme connectant les deux voies métaboliques n’a pu être élucidé. Fait intéressant, un nouveau mécanisme qui peut être éventuellement impliqué dans l’initiation de la synthèse de novo des acides gras chez Pseudomonas aeruginosa a été découvert. Ce mécanisme conférerait un avantage métabolique qui faciliterait le développement cellulaire dans un milieu contenant des acides gras à chaîne de longueur moyenne.

Le troisième chapitre aborde la caractérisation de l’enzyme RhlA de P. aeruginosa par une approche mutationnelle. Cette étude apporte des précisions importantes sur un motif qui est impliqué dans l’interaction protéine-substrat, ce qui permet de moduler la sélectivité de l’enzyme. Ces résultats constituent une base pour des études ultérieures visant l’amélioration de l’efficacité catalytique de l’enzyme et la production de congénères de rhamnolipides aux propriétés distinctes.

Abstract

Surface-active compounds have a high industrial interest in modern society due to their numerous associated applications. Indeed, considering the many applications of surfactants in different fields (pharmaceutical, food, cosmetics, textile, paints, agricultural, paper, oil recovery and cleaning, among others), it is possible to imagine the great extent of the use of these compounds in a variety of everyday consumer products. Unsurprisingly, with the substantial and versatile use of surfactants, this industry benefits from a multi-billion dollar global market. This market is well-consolidated and is increasing due to the growth of industrialization in third world countries, product diversification, general improvement of living standards and continued population growth. In addition to the global demand for surfactants, production of these compounds also consumes very large quantities of petrochemical raw materials and natural fats. Furthermore, the massive use of surfactants in household products such as detergents and cosmetics, and their subsequent disposal in aquatic systems, are a strong motivation to replace conventional synthetic surfactants with environmentally friendly compounds. This transition notably involves the development of molecules that are more easily biodegradable and less toxic. On the other hand, the reasons justifying the search for replacement surfactants are therefore not only environmental, but also include consumption forecasts that raise economic concerns as competition between the various hydrocarbon exploitation sectors intensifies and the supply of crude oil resources becomes more difficult to access. New research is gradually moving towards the study of molecules of biological origin exhibiting lower toxicity, provided that these molecules have comparable surfactant properties, in order to obtain products more respectful of the environment with comparable or higher quality than conventional surfactants. This is a complex task that is still in its early stages of development.

Microbial biosurfactant industrial production is an attractive technology, encouraging and supporting sustainable development within a globalized society, particularly in the face of global challenges such as climate changes, loss of biodiversity, and food and energy security concerns.

The discovery of rhamnolipids in 1946 launched a line of research that has since become particularly active, notably aimed at characterization of structural diversity, biosynthesis pathways, and physicochemical properties, along with industrial production optimization and application development. However, in spite of their excellent surfactant properties and their safety for humans and the environment, rhamnolipids still account for only a discrete proportion of the surfactants global market. Higher production costs of rhamnolipids with respect to synthetic surfactants hamper their large-scale exploitation; this is influenced by several factors, especially the costs and availability of raw material and the ability of strains to reach high production yields. Thus, investigation of such factors is important to minimize production costs.

As a biologist, the potential of metabolic and protein engineering to achieve higher rhamnolipid production yields is very attractive. Nevertheless, understanding metabolic mechanisms by which rhamnolipids are synthesized is the key to design effective metabolic strategies. Moreover, the lack of structural characterization of proteins involved in the rhamnolipid biosynthesis pathway, limits the use of protein evolution approaches.

The aim of this research work was to expand our knowledge of the rhamnolipid precursor biosynthesis mechanism, in order to provide new insights for the design of strategies allowing to increase the carbon flux toward the glycolipid pathway. This issue was addressed through two different perspectives; a metabolic study of the fatty acid supply pathway for the biosynthesis of rhamnolipids and a mutational characterization of RhlA, a key enzyme involved in the biosynthesis of the lipid precursor of rhamnolipids.

Chapter one is a short overview of rhamnolipids. This literature review includes various aspects related to rhamnolipid discovery, structural diversity, producing bacteria, biological roles, surfactant properties and potential applications in the industrial field as well as in daily consumer products.

Chapter two investigates the challenges of two different models, wherein fatty acids are used within the rhamnolipid biosynthesis pathway. These models were proposed by Zhang et al. (2012) and Abdel-Mawgoud et al. (2014) and remain a controversial discussion topic today. The results presented provide more evidence for the implication of a β-oxidation intermediate metabolite having an aliphatic chain length of ten carbons. Nevertheless, the shunt mechanism of this intermediate toward rhamnolipid synthesis still remains unidentified. Interestingly, an unknown mechanism potentially playing a role in de novo fatty acid synthesis in Pseudomonas aeruginosa was brought to light, a further evidence of the metabolic versatility of this bacterium which could allow its development in a medium size fatty acid chain environment.

Chapter three concentrates on RhlA characterization from P. aeruginosa using a mutational approach. This study provides important details concerning a putative motif involved n protein-substrate interactions allowing modulation of substrate selectivity. These results provide a basis for further thoughts to improve catalytic efficacy and design specific surfactant glycolipids.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Doucet, Nicolas
Co-directeurs de mémoire/thèse: Déziel, Éric
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 21 nov. 2019 16:42
Dernière modification: 21 nov. 2019 16:42
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/8513

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