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Inhibition du virus de l'herpès simplex par la protéine cellulaire upstream binding factor

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Ouellet Lavallée, Gabriel (2018). Inhibition du virus de l'herpès simplex par la protéine cellulaire upstream binding factor Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, doctorat en immunologie et virologie, 183 p.

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Résumé

La protéine cellulaire Upstream Binding Factor (UBF) est un facteur de transcription critique pour la production de transcrits ribosomaux par l’ARN polymérase I. UBF est normalement localisée au nucléole où elle accomplit ses fonctions cellulaires. Suite à l’infection de la cellule hôte par le virus de l’Herpès Simplex 1 (VHS-1), la localisation d’UBF change et devient distribuée sous forme de multiples points dans le noyau.

Des résultats publiés du laboratoire ont montré que la relocalisation d’UBF est détectée initialement ailleurs qu’aux compartiments de réplication virale (CRV). Cependant, le rôle d’UBF dans l’infection par le VHS-1 demeurait inconnu.

La méthode choisie pour déterminer la fonction d’UBF durant l’infection a été de diminuer son expression par interférence à ARN. Cela a permis de découvrir qu’UBF restreint la réplication virale. En effet, la diminution de son expression a résulté en une plus grande production de particules virales infectieuses ainsi qu’une accumulation plus importante d’ADN, de transcrits, et de protéines virales. De plus, une inhibition de la réplication de l’ADN viral a permis de démontrer qu’UBF interfère avec la réplication virale à partir du génome entrant.

Des analyses de colocalisation entre les points d’UBF et divers facteurs viraux par microscopie confocale ont ensuite été faites. Les résultats de ces expériences ont pu démontrer que les points d’UBF ne colocalisent pas initialement avec les CRV, ni leurs précurseurs, les pré-CRV. Par contre, les points d’UBF sont colocalisés avec les génomes entrants dans une certaine proportion.

La proportion avec laquelle les points d’UBF et les génomes viraux colocalisent varie selon la multiplicité d’infection (MOI) utilisée. À plus forte MOI, une plus grande proportion des génomes viraux est dépourvue d’UBF, alors que l’inverse est observé à plus faible MOI. Parallèlement à ce phénomène, une infection virale à plus forte MOI est moins affectée par la présence d’UBF qu’une infection à plus faible MOI. Une MOI plus élevée semble donc réduire la susceptibilité à UBF en réduisant sa colocalisation avec les génomes viraux.

Des expériences avec un virus mutant ont pu ensuite identifier une protéine virale responsable de cet effet dépendant de la MOI. Un virus dont le domaine d’activation du facteur de transcription viral VP16 est absent ne produit pas ce phénomène dépendant de la MOI. La proportion de génomes viraux et d’UBF colocalisés reste élevée peu importe la MOI. Le domaine d’activation de VP16 semble donc requis pour prévenir la colocalisation entre le génome viral et UBF et possiblement pour contrecarrer son effet antiviral.

Deux isoformes d’UBF existent, soit UBF1 et UBF2, et des fonctions uniques à celles-ci ont été répertoriées. Il était donc pertinent de déterminer si une isoforme en particulier était responsable de l’effet antiviral. Une expression ectopique d’UBF1 ou d’UBF2 dans des cellules où l’expression d’UBF endogène est diminuée a permis de déterminer que les deux isoformes peuvent restreindre la réplication virale.

L’ensemble des résultats obtenus décrit pour la première fois une fonction antivirale menée par UBF. Le modèle proposé est qu’UBF est relocalisée aux génomes viraux après leur entrée dans le noyau de la cellule hôte. À ce moment, UBF interfère avec la production de transcrits et limite ainsi la réplication virale. Une fonction qui dépend de la protéine virale VP16 peut cependant contrecarrer cette inhibition en prévenant la colocalisation entre UBF et les génomes viraux.

Abstract

The cellular protein Upstream Binding Factor (UBF) is an essential factor in rRNA transcription and is localised in the nucleolus. After infection by Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1), UBF is relocalised in the nucleus in distinct foci.

Published results from our laboratory showed that UBF relocalisation is initially detected outside of viral replication compartments (VRC). However, the precise role of UBF in HSV-1 infection remains undetermined.

A siRNA knock-down approach was chosen to identify UBF’s role in HSV-1 infection. This allowed the discovery that UBF has an antiviral effect. Indeed, UBF knock-down results in an increase in infectious viral particles as well as in viral products such as viral transcripts, proteins, and DNA. Moreover, inhibition of viral DNA replication showed that the inhibitory effect of UBF on viral transcription is mediated on the input genomes.

Colocalisation analysis between UBF foci and viral components was subsequently performed by confocal microscopy. Results showed that UBF does not initially colocalise with VRC, or with pre-VRC. They do however colocalise with input viral genomes at a certain ratio.

The ratio of colocalisation between UBF foci and input viral genomes varies depending on the multiplicity of infection (MOI) used. At a higher MOI, the ratio of colocalisation decreases whereas this ratio is higher at a lower MOI. The use of a higher MOI also diminishes the UBF-mediated inhibition of replication. A higher MOI therefore seems to render infection less susceptible to UBF by preventing colocalisation between UBF foci and viral genomes.

Subsequent experiments with a viral mutant allowed the identification of a viral protein responsible for the MOI-dependant effect. A mutant in which the activation domain of the transcription factor VP16 is absent does not produce this MOI-dependent effect. The ratio of colocalisation remains high at all MOI tested. The VP16 activation domain therefore seems required to block colocalisation between UBF foci and viral genomes, and possibly counter the UBF-mediated inhibition of replication.

Two isoforms of the UBF protein exist, UBF1 and UBF2, and functions unique to each have been published. It was therefore important to determine if an isoform in particular is responsible for the inhibition of HSV replication. Ectopic overexpression of UBF1 or UBF2 in cells knocked-down for endogenous UBF was performed. Results showed that either UBF isoform can inhibit viral replication.

Taken together, these results describe for the first time an antiviral function carried out by UBF. The proposed model is that relocalisation of UBF to input viral genome happens after entry in the host nucleus. UBF then interferes with the production of viral transcripts which results in a limited viral replication. A function dependent on the viral protein VP16 can counteract this inhibition by preventing the colocalisation of UBF foci with viral genomes.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Pearson, Angela
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 28 janv. 2020 21:09
Dernière modification: 28 janv. 2020 21:09
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/8505

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