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Contribution à l'étude des déterminants viraux influençant la pathogénicité des coronavirus bovins

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Michaud, Layla (1995). Contribution à l'étude des déterminants viraux influençant la pathogénicité des coronavirus bovins Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maitrise en virologie, 203 p.

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Résumé

Depuis 1987, plusieurs isolats de coronavirus bovins ont été récupérés des contenus intestinaux de veaux diarrhéiques et de bovins adultes atteints de la dysenterie d'hiver provenant de fermes de 6 régions différentes du Québec. La présence du virus a été confirmée en microscopie électronique et par enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) . Les isolats ont été adaptés et propagés pour 3 à 5 passages sur cellules HRT-18 en présence de trypsine. Les souches de référence, ainsi que les différents isolats québécois, ont été purifiés par ultracentrifugation différentielle et isopycnique sur gradient de densité de saccharose. Les virus furent récupérés au niveau des fractions correspondant à des densités de flottation de 1.16 à 1.18 g/ml de saccharose. La présence de particules coronaviriformes a été confirmée en microscopie électronique après incubation en présence d'un antisérum dirigé contre la souche Mebus du coronavirus bovin et marquage à la protéine-A couplée à l'or colloïdal.

La propagation des virus sur les cellules HRT-18 a permis l'identification de trois groupes distincts selon le type d'effet cytopathogène (ECP) induit par ces derniers. Tous les isolats récupérés de cas de dysenterie d'hiver se sont avérés hautement fusogéniques. Pour mieux visualiser les différents types d'ECP en microscopie photonique, nous avons utilisé la technique d'immunoperoxidase indirecte. Lors d'épreuves d'hémagglutination (HA), tous les isolats de coronavirus bovin ainsi que le coronavirus TCV de la dinde, le coronavirus HEV porcin et le coronavirus respiratoire humain HCV-OC43 se sont avérés hémagglutinants lorsque testés contre des érythrocytes de rat. Les isolats associés à la dysentérie d'hiver étaient dépourvus de cette activité lorsque testés à 37°C, mais étaient comparables aux autres coronavirus bovins lorsque testés à 4°C. Les évaluations quantitatives de l'activité destructrice de récepteurs (RDE) ont permis de classer les isolats de coronavirus bovin en deux sous-groupes différents, cette activité étant plus élevée pour les isolats associés à la dysentérie d'hiver. En ce qui a trait à l'activité acétyl-estérase, aucune variation significative n'a pu être observée. Les analyses d'électrophorèse sur gels de polyacrylamide n'ont pas permis de révéler de différences majeures entre les isolats de BCV.

Pour les fins de comparaison sérologique, un antisérum hyperimmun produit chez le lapin contre la souche Mebus du coronavirus bovin ainsi que des anticorps monoclonaux (AcMo) dirigés contre les glycoprotéines S et HE du BCV, ont été utilisés. La réactivité des AcMo envers les isolats de BCV associés aux épisodes de diarrhée néonatale du veau a été analysée selon différentes épreuves sérologiques. Ces AcMo avaient été obtenus lors d'expériences de fusion réalisées à l 1aide de splénocytes de souris immunisées contre la souche de référence du Nébraska et les cellules myélomateuses Sp2/0 non-sécrétrices . Les tests d'inhibition de l'hémagglutination(IHA) ont permis l'identification de deux isolats se différenciant sérologiquement de la souche prototype. Les analyses des profils polypeptidiques par la technique d'immunobuvardage de même que les tests d'immunofluorescence et de séroneutralisation, à l'aide de l'antisérum polyclonal de référence, ont démontré que tous les isolats québécois de BCV partageaient des déterminants antigéniques au niveau de chacune de leurs protéines structurales.

Des épreuves d'ELISA compétitives réalisées entre des AcMo dirigés contre la glycoprotéine S ont permis l'identification de 4 domaines antigéniques majeurs A,B,C et D au niveau de la glycoprotéine S. Les épitopes associés à l 1activité neutralisante du virus ont été localisés sur les sites A, B et C. Le domaine antigénique D de la glycoprotéines, de même que les épitopes non-neutralisants assignés aux domaines antigéniques A et C sont apparus très conservés parmi les isolats québécois de BCV. La souche minnesota du coronavirus entérique de la dinde a pu être différenciée de la souche Mebus du BCV par les épitopes appartenant au domaine C. Le coronavirus humain HCV-OC43 se différenciait par les épitopes appartenant au domaine antigénique A. Quant au coronavirus hémagglutinant de l'encéphalomyélite porcine(HEV), il pouvait être distingué des autres coronavirus hémagglutinants par les épitopes neutralisants localisés sur les domaines antigéniques A, B et C. Toutefois, les tests d'ELISA réalisés avec ces mêmes AcMo ont permis de reconnaître trois différents sous-groupes antigéniques parmi les isolats québécois de BCV.

Au niveau moléculaire, nous avons testé la réactivité des différents virus étudiés envers une sonde moléculaire couvrant entièrement le gène codant pour la glycoprotéine HE de la souche Mebus du BCV. De plus, nous avons procédé à l'analyse des séquences nucléotidiques de ce gène et ce, pour différents isolats de BCV. Les épreuves d'hybridation moléculaire ont permis l'identification de tous les isolats de coronavirus possédant le gène codant pour la glycoprotéine de l'hémagglutinine. Aucune réactivité de la sonde moléculaire envers des virus à ARN ou à ADN hétérologues n'a été obtenue. Selon l'analyse des séquences nucléotidiques, aucune variation significative n'a pu être observée au niveau du gène HE des isolats associés aux épisodes de diarrhée néonatale du veau. La majorité des mutations se retrouvaient au niveau des extrémité 5' et 3' du gène. Aucune délétion ou insertion n'a été observée. Lors de l'analyse de la séquence d'acides aminés, 50% des mutations nucléotidiques se sont avérées silencieuses. Toutefois, des changements significatifs ont été observés au niveau de la séquence du gène HE de l'isolat WD.2590 associé à la dysentérie d'hiver. Au moins trois changements majeurs ayant résulté en 1 'apparition de trois nouveaux résidus proline ont été identifiés. Pour les isolats de BCV analysés, aucune modification n'a pu être observée au niveau du site acétylestérase, cependant, pour l'isolat associé à la dysenterie d'hiver, l'inclus ion d'un résidu proline immédiatement en amont du site de clivage a été identifiée, ce qui pourrait expliquer les changements observés au niveau des activités HA, AE et RDE.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Dea, Serge
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 08 août 2019 01:55
Dernière modification: 08 août 2019 01:55
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/8218

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